Эпителиальные клетки дыхательных путей (AEC) являются одними из первых мест контакта при ингаляционных инсультах и ​​играют решающую роль в поддержании нормальной функции дыхательных путей [5, 6]. Эпителий дыхательных путей представляет собой первичный участок соответствующих молекулярных и гистологических изменений как при МВ, так и при ХОБЛ, и в последние годы появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что он играет ключевую роль в возникновении и прогрессировании обоих заболеваний. Структурные и функциональные изменения как в дыхательных путях, так и в альвеолярном эпителии оказывают существенное влияние на изменение среды дыхательных путей, защитные механизмы хозяина и процессы восстановления, которые способствуют ограничению воздушного потока, характерному для обоих заболеваний.Таким образом, эпителий дыхательных путей может представлять собой подходящую мишень для новых терапевтических стратегий, направленных на восстановление целостности барьера и защиты от вдыхаемых частиц и патогенов. В этом обзоре мы рассматриваем доказательства критической роли дисфункционального эпителия дыхательных путей в нарушении местной защиты, измененных иммунных реакциях, хроническом воспалении дыхательных путей и ремоделировании при МВ и ХОБЛ, подчеркивая общие механизмы, участвующие в дисфункции эпителия, а также сходства и различия двух болезней.

2. Свойства эпителия дыхательных путей

Эпителий дыхательных путей действует как физический барьер, предотвращающий попадание потенциальных патогенов или вредных агентов на слизистую дыхательных путей и попадание в кровоток [7]. Кроме того, эпителий дыхательных путей контролирует транспорт ионов для поддержания гидратации дыхательных путей и, кроме того, действует как ключевой регулятор врожденных иммунных ответов на вторжение патогенов.

2.1. Барьерная функция

Пересечение одного или нескольких барьеров хозяина патогеном имеет решающее значение для инициации инфекции.Эпителий дыхательных путей обеспечивает физический барьер для микробной инвазии; он состоит из монослоя поляризованных эпителиальных клеток, которые поддерживают свою целостность за счет комплексов апикальных соединений (AJC). Они состоят из закупоривающих плотных соединений (TJ), закрепляющих адгезионных соединений (AJ), десмосом и GAP-соединений.

TJ регулируют движение ионов, макромолекул и иммунных клеток через межклеточное пространство; они имеют решающее значение для переноса ионов и действуют как барьер, регулирующий доступ воспалительных клеток и препятствуя проникновению вредных веществ, таких как микробные компоненты, в просвет дыхательных путей.TJ сконструированы из белков zona occludens (ZO), окклюдина, клаудинов и соединительных молекул адгезии (JAM). AJs обеспечивают межклеточную адгезию и сигнальные пути, которые контролируют рост, морфологию и дифференцировку клеток. Они расположены ниже TJ в t

Многослойный плоский ороговевший эпителий

ГИСТОЛОГИЯ ПОЛНЫЙ ТЕКСТ

Раздел 3l РЕГЕНЕРАЦИЯ

A ОБЩИЕ ПОНЯТИЯ

ИСХОДНЫЕ КЛЕТКИ (а) Выжившие дифференцированные клетки (могут дедифференцироваться)
     | (б) Выжившие недифференцированные стволовые клетки
     | (c) Циркулирующие клетки в крови
     |
пролиферация 1 Стимулируется: пониженной плотностью упаковки клеток?
     | Физиологическая перегрузка? Факторы роста? Потеря роста
     | ингибиторы?
     | 2 Клеточные мембраны «чувствуют», что ткани отсутствуют, и
     | предложили мигрировать? и размножаться?
     |
     |
     V Специализация
НАСЕЛЕНИЕ КЛЕТОК -------------------------> ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ
                            вызванный
                                                      
                       1 Поддерживаемые нормативные программы
                       2 Непрерывность регенерирующей части со зрелой,
                          специализированная часть, эл.г., в скелетных мышцах
                          волокно
                       3 Индуцирующие вещества / факторы
                       4 Взаимодействие с внеклеточным матриксом
                       5 Ячеечные контакты и щелевые переходы
                       6 Механически и электрически
                          поляризованные поля

 

3 Организация дифференцирующихся клеток для восстановления органа
l Требуется координация регенераций более чем одной ткани, e.грамм., (а) железистые клетки, кровеносные сосуды и стромальные клетки, ECM и более поздние ретикулярные элементы, чтобы построить новые дольки в печени; (б) волокна скелетных мышц, соединительные ткани и нервные волокна для регенерации мышц и восстановления скелетно-мышечная функция. Ткани взаимодействуют индуктивно и трофически.
2 Регенерации тканей могут конкурировать , с функционально неблагоприятный исход, например,
.. (а) коллагеновая соединительная ткань может перерасти регенерирующий хрящ и кость при переломе скелета, и заполнить разрыв перелома фиброзным ткань недостаточно жесткая для поддержки;
.. (б) в поврежденном мозге глиальные клетки размножаются и активно подавляют рост аксонов.

4 Требования к регенерации
l Пространство : для роста ткани требуется пространство и само по себе ответ, подтверждающий наличие пространственного дефекта. Где ткань была поврежденные, фагоцитоз и лизис некротической ткани освобождают место для новых клетки. Когда дефект заполнен, пролиферация клеток снижается или остановился.Это торможение происходит даже тогда, когда «неправильная» ткань, например фиброзная CT восполняет пробел.
2 Связь между участвующими клетками посредством цитокинов и другие агенты.
3 Адекватный уровень гормонов, например, щитовидной железы.
4 Достаточное количество запасов или потребление аминокислот, витаминов и т. Д. Для синтез нового белка и других материалов.
5 Свобода от инфекции.
6 Неповрежденный кровоснабжение и дренаж для этой области.Иногда тоже продолжающаяся иннервация является необходимым координирующим и трофическим фактором.

5 Гиперплазия и гипертрофия
l Гиперплазия — это реакция ткани, включающая митоз и образование новых ячеек, увеличение количества ячеек для удовлетворения спроса на большее вывод, например, железистой секреции.
2 Hypertrophy снова пытается удовлетворить потребность в повышенных усилиях или выхода, не за счет пролиферации клеток, а за счет клеток в их исходном количество увеличивая их размер и, следовательно, содержание продуктивных органелл и материалы, д.g., гладкомышечные клетки матки при беременности.

6 Регенерация и физиологическая регенерация
l Физиологическая регенерация — это нормальный непрерывный процесс, например, в эпителии кишечника или постоянно, например, в эпителии волосяного фолликула, включая деление клеток для замещения клеток, потерянных естественным путем.
Это явление демонстрируют клетки крови, эпителиальные клетки, клетки костей и соединительной ткани. С другой стороны, мышечные, хрящевые и нервные клетки стабильны и статичны. клетки, в зрелости.
2 Ткани, регенерирующиеся физиологически без травм, лучше регенерируют для восстановления повреждений, чем те, которые имеют стабильные долгоживущие клетки.

ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ И СОЕДИНИТЕЛЬНЫЕ ТКАНИ

2 Под эпителием
l Кровь образует сгусток с фибриновыми волокнами, тромбоцитами и фибронектином.
2 Лейкоциты мигрируют через неповрежденные стенки сосудов; полиморфы атакуют несколько бактерий и моноцитов удаляют остатки клеток и фибрин. (The воспалительная реакция и агенты, участвующие в ней, например, влияющие на капиллярные проницаемость и миграция лейкоцитов будут изучены при патологии и фармакология.)
3 Фибробласты в CT становятся активными, пролиферируют, мигрируют в сгусток, и закладывают новые волокна коллагена, гликопротеины и протеогликаны в конструкции грануляционная ткань .
4 Эндотелиальные клетки разрезанных капилляров одновременно пролиферируют и двигаться в сгусток, восстанавливая капиллярную сеть.
5 Продолжение деятельности по этим нескольким направлениям приводит к быстрому образование новой собственной пластинки.Между тем,

3 В эпителии
l Эпителиальные клетки по краям разреза мигрируют из в виде тонкого слоя, проникая в фибрин, и заменяя временную подложку из фибронектин и тенасцин с базальной пластинкой в ​​качестве надежной и постоянной поддержки.
2 Пока эпителиальная поверхность восстанавливается как тонкий лист, ее клетки начать умножить и дифференцировать , чтобы восстановить исходный толщина и разнообразие специализированных клеток эпителия.
3 Поскольку новый эпителий должен врастать с краев, степень зияние разреза определяет расстояние, на котором клетки должны мигрировать, а значит, и время, необходимое для исцеления. Порезанные края раны поэтому должны быть втянуты в стык с помощью швов. Чем раньше эпителий восстанавливается, тем раньше подлежащая ткань защищается от инвазия патогенными организмами.
Выше описана плавная, постепенная последовательность исцеления первым Сибирь .
4 Уцелевшая глубокая часть экзокринных желез может служить источником регенеративные эпителиальные клетки для замены поверхностного эпителия, кроме того к потерянной части железы. Показательные примеры:
(i) в физиологическом восстановлении слизистой оболочки матки от базального слой эндометрия после менструации;
(ii) замещение эпидермиса потовых желез (и волосяных фолликулов) после ожог второй степени убил более поверхностные эпителиальные клетки.

Хотя регенерацию эпителия и КТ лечили отдельно, в жизни эти процессы, да и их обычная повседневная работа тесно координируется цитокинами и взаимодействиями клеточного матрикса.

В общем, восстановление может восстановить как эпителий, так и его собственную пластинку. соединительной ткани почти в таком же хорошем состоянии, как и раньше. Когда есть патологическая задержка, цитокины пробуют, чтобы ускорить эпителиальный событиях и для ускорения строительства собственной пластинки.

C РЕМОНТ МАСШТАБА

D МЫШЕЧНАЯ РЕГЕНЕРАЦИЯ

2 Гладкая и сердечная мышца
l Радиоавтографические исследования показывают, что гладкомышечные клетки, например, в кишечника, способны к некоторой пролиферации для замены поврежденных клеток и частично восстановить преемственность в мышечной оболочке.
2 Сердечная мышца находится в невыгодном положении, поскольку не может расслабиться и отдохнуть на период, позволяющий деление клеток и реорганизацию мышц; и может быть ранний и неблагоприятный ответ от его КТ.
Точно так же легкое из-за своей эластичности и подвижности, а также других факторов не может эффективно работать. регенерация, несмотря на его эпителиальное содержание.
3 Срезы сердечной мышцы быстро заполняются с помощью КТ коллагена, но мышечные волокна, поврежденные инфекциями, могут восстанавливаться.
В общем, тогда большое мышечное поражение будет заполнено C.T. Только образуется небольшое количество новой мышечной ткани, чтобы заменить утраченную или заполнить пробелы. Выжившие мышечные волокна могут гипертрофироваться в попытке восстановить силу мышца в целом.

E Кость и хрящ

l Перелом длинных костей (с участием стержня)
l Начальная фаза

• (a) Костные края и костный мозг вдоль линии перелома отмирают, потому что кровь сосуды разорваны, что приводит к кровотечению в щель перелома.
• (b) Надкостница отрывается от поверхности кости.
• (c) Молодые кости могут ломаться, не повреждая надкостницу — так называемые перелом «зеленая палочка», но воспаление все равно возникает.

• (a) Лейкоциты и кровь капилляры растут, удаляя фибриновый сгусток и некротизированные мягкие ткани.
• (b) Остеокласты местами размывают край мертвой кости.
• (c) Фибробласты , из фиброзной надкостницы и прилегающей КТ, попытайтесь врастают в щель и образуют коллаген.
• (d) Дальше от разрыва уцелевшие периостальные и эндостальные клетки становятся активными и закладывают новые кости и хрящи.
• (e) Пролиферирующие остеобласты, хондробласты и фибробласты включают бластема .

• (a) Видно, что новая кость может быть положена на живую кость, мертвую кость, кальцинированный хрящ и как отдельно стоящие независимые трабекулы.
• (b) Распределение новых твердых тканей, называемых каллусом , следующее:
  • (i) На эндостальной кости и в полости костного мозга в виде костного слоя и как трабекулы, вместе называемые внутренняя / эндостальная мозоль .
  • (ii) На живой кости вне диафиза в виде костного слоя и отдельно стоящие трабекулы и, ближе к оторванному краю, как быстро сформирована большая масса гиалинового хряща. Новая кость расширяется постепенно в хрящ в процессе эндохондрального окостенение, проявляющееся в развитии длинных костей.
    Эти объемные внешние ткани составляют наружных / надкостничных каллус .

• (a) Если сломанные концы разделены только узкой щелью излома, Надкостничные и эндостальные мозоли, растущие с каждой стороны, могут встречаться и сливаться, в результате получается соединение .
• (b) Однако в более широкой щели фибробласты могут расти и заполнять ее плотным фиброзная КТ.
• (c) Фиброзное соединение ( несоединение ) уменьшает дальнейшее образование новых кость, и оставляет две части скелетной кости свободными для движения, то есть псевдоартроз образуется и может даже приобретать хрящ и синовиальная оболочка.

• (a) Когда происходит слияние костных трабекул и гиалинового хряща, хрящ быстро замещается эндохондральной костью.
• (b) Костные трабекулы (тканой кости) сначала заполняют полость костного мозга, пространство между кончиками костей и гордо возвышается над внешней поверхностью кость. Эта костная мозоль будет реконструирована:
  .. (i) для восстановления костного мозга изнутри,
  .. (ii) для уменьшения высокого контура наружной кости,
  .. (iii) в то же время, чтобы его плотность увеличилась за счет замены из плетеной кости за пластинчатой ​​костью.

• (a) Один сломанный кусок кости может быть на смещен на от оси другое, или быть неуместным анатомически.
• (b) Оси полученных двух частей не могут быть совмещены или параллельны: детали угловые .
• (c) В месте перелома кость может расколоться на множество мелких фрагментов — измельчение излома.
• (d) Эти костные фрагменты обычно погибают, но некоторые из их поверхностных клеток а соседние клетки образуют новую кость, которая удерживает мертвую кость в место, где его жесткая природа используется в качестве случайного костного трансплантата .Мертвая или живая кость может быть установлена ​​хирургическим путем в качестве преднамеренного трансплантата в разрыв трещины. Любой костный трансплантат используется в качестве временной твердой ткани, и в конечном итоге рассасывается и заменяется новой костью.
• (e) В идеале не оставлять значительный зазор трещины, а вмешаться рано, чтобы подвести и удерживать концы костей в плотном прилегании, и правильно расположен. Эта процедура называется редукцией перелом.

4 Хрящ
l Как и в случае с костью, восстановление ткани осуществляется за счет покрытия поверхности — надхрящница.
2 В молодости, когда он еще активен в аппозиционном росте, надхрящница может восстановить значительные дефекты.
3 В зрелом хряще дефекты, скорее всего, будут заполнены фиброзной КТ или поражение может ускорить дегенерацию прилегающего хряща.
При отсутствии перихондрия суставные поверхности особенно неспособны восстанавливать наносить ущерб. В терминальной стадии остеоартроза хрящ полностью изношен. прочь, оставляя болезненные царапающие концы костей.

ТКАНИ АССОРТИ

G НЕРВНАЯ ТКАНЬ

Frontiers | Метод количественной оценки способности эпителия колонизации патогенными бактериями

Введение

Исторически исследования микроорганизмов проводились на культурах, выращиваемых в жидком бульоне или на чашках с агаром.Однако традиционные лабораторные культуры редко отражают реальные условия роста в естественной среде обитания микроорганизмов. При выращивании в естественной среде обитания экспрессия генов и фенотипические характеристики часто значительно различаются (Brock, 1971; Branda et al., 2001; Kuthan et al., 2003; Palková, 2004). То же самое и с патогенными бактериями, которые колонизируют и проникают в организм человека (например, Smith, 1998; Krismer et al., 2014; Zapotoczna et al., 2016). Здесь иммунные эффекторы, ограниченная доступность питательных веществ и гидродинамические условия резко влияют на рост бактерий и заставляют их использовать альтернативные стратегии роста и активировать стрессовые реакции.

Типичной реакцией на такие стрессовые условия является образование бактериальной биопленки. Бактериальная биопленка привлекла большое внимание в последние десятилетия, что привело к созданию нескольких методов для изучения этой специфической реакции роста (Lebeaux et al., 2013; Azeredo et al., 2017). Такие модели обычно включают культивирование биопленок на абиотических поверхностях, таких как стекло или пластик, в некоторых случаях покрытых специфическими белками для имитации биологической поверхности (Djordjevic et al., 2002; Lembke et al., 2006).

Первым барьером хозяина, с которым сталкиваются вторгшиеся бактерии, часто являются эпителиальные слизистые оболочки, выстилающие внутренние трубчатые структуры тела. Для изучения способности вторгающегося патогена прилипать к этой внутренней поверхности обычно применяется так называемый статический анализ адгезии микротитровального планшета. В этом простом и высокопроизводительном методе бактерии добавляются к прилипшим культурам эпителиальных клеток с последующим центрифугированием для облегчения контакта бактерий с клетками. Наконец, прилипшие / инвазивные бактерии количественно оцениваются путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) на чашках с агаром (например,г., Берри и др., 2009; Letourneau et al., 2011). Это позволяет оценить функциональную силу адгезии клеток эпителия к бактериям. Однако этим методом можно исследовать только начальный контакт между клетками, поскольку совместное культивирование в статической системе приводит к быстрому истощению питательных веществ, чрезмерному росту бактерий и деградации культуры клеток.

Недавние исследования показали, что продолжительные эксперименты по бактериально-эпителиальной инфекции можно смоделировать с использованием моделей инфекции на основе проточной камеры.Такие модели облегчают изучение взаимодействия бактерий и эпителия под воздействием физиологического сдвига жидкости (Andersen et al., 2012; Alsharif et al., 2015; Khandige et al., 2016; Stærk et al., 2016). Кроме того, они индуцируют in vivo -подобных адгезионных стимулов у бактерий, а также возможность изучить влияние физиологического микроокружения на механизмы патогенеза (Andersen et al., 2012; Khandige et al., 2016). Хотя экспрессия специфических бактериальных генов и фенотипические изменения могут быть исследованы на таких моделях потока, они не были оптимизированы для точной количественной оценки развития бактериального укоренения и образования биопленок на слоях эпителиальных клеток.Бактерии могут быть извлечены из проточных камер через определенные промежутки времени для определения КОЕ. Однако для этого необходимо завершить довольно трудоемкий эксперимент, оставив только одну точку данных, измеренную на камеру. Более того, подсчет КОЕ бактерий, подвергшихся воздействию in vivo в условиях стресса, подобных , может быть затруднительным, поскольку бактерии могут изменять морфологию, то есть становиться нитевидными (Klein et al., 2015; Khandige et al., 2016) или агрегироваться (Loof et al., 2015; Grønnemose et al., 2017; Sønderholm et al., 2017) или замедлить скорость роста (Proctor et al., 2006), что может повлиять на точность количественного определения бактерий с помощью традиционных методов посева.

Здесь мы представляем метод, который позволяет обойти эти проблемы, обеспечивая точное и воспроизводимое количественное определение бактериальной колонизации на слоях эпителиальных клеток в физиологических гидродинамических условиях. Метод демонстрируется на трех моделях инфекции, имитирующих инфекцию мочевыводящих путей, кишечную инфекцию и инфекцию кровотока, вызванную важными патогенами человека; уропатогенный токсин и токсин шига Escherichia coli (UPEC и STEC соответственно) и Staphylococcus aureus .

Бактериальная колонизация культивируемых в проточной камере слоев уроэпителиальных, кишечных эпителиальных и эндотелиальных клеток определяется количественно на основе сигналов флуоресценции от прикрепившихся бактерий, которые конститутивно экспрессируют зеленый флуоресцентный белок (GFP). Покадровая микроскопия и количественная оценка бактериального покрытия выполняется в нескольких заранее определенных местах на слоях клеток для получения точных средних общих значений прогрессии роста, а также информации о структуре роста. Этот метод расширяет стандартный анализ адгезии бактерий к эпителию на основе микротитрационного планшета, включая условия гидродинамического стресса и непрерывный мониторинг колонизации бактериальной поверхности в течение продолжительных периодов времени.Кроме того, он открывает возможности для подробных исследований влияния известных или потенциальных факторов вирулентности, иммунных эффекторов или противомикробного лечения на прогрессирование инфекции. Здесь мы демонстрируем эту применимость в исследовании влияния фимбрий E. coli типа 1 (T1F) на адгезию / колонизирующую способность UPEC на слои клеток уроэпителия в потоке искусственной мочи. Хотя хорошо известно, что адгезин кончика T1F FimH взаимодействует с уроплакином на поверхности уроэпителиальных клеток и способствует адгезии / инвазии в мочевыводящие пути (Zhou et al., 2001; Bouckaert et al., 2006), его влияние на бактериальную колонизацию уроэпителия, насколько нам известно, не было определено количественно непосредственно при непрерывном мониторинге in vitro . Существующий метод однозначно позволяет проверить это в соответствующих физиологических условиях.

Материалы и методы

Бактерии, клетки и условия роста

Инфекция кишечника: продуцирование токсина шига Escherichia coli Колонизация слоев клеток кишечника (T84)

Слои клеток Т84, культивируемые в проточной камере (ATCC CCL-248), использовали для моделирования эпителия кишечника человека.Клеточная линия T84 представляет собой бессмертную линию эпителиальных клеток кишечника, полученную из метастазов в легких пациента с карциномой толстой кишки. Клетки Т84 субкультивировали в колбах Т25 (Nunc, Easy Flask, Delta Surface) при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ с использованием среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) / F-12 с GlutaMAX ^TM (Gibco ) с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки (FBS) (Sigma) и 1% пенициллин-стрептомицина (PS) (запас: 10.000 единиц / мл пенициллина, 10.000 мкг / мл стрептомицина, Gibco) в качестве среды для роста.Эксперименты проводились с использованием Т84 в пассажах 57-77. Клетки высвобождали из культуральных колб с использованием трипсин-ЭДТА (Sigma), ресуспендировали в 5 мл клеточной среды, из которых 150 мкл добавляли в проточные камеры (1 мкл-слайд I ^0,6 Luer Collagen IV, Ibidi, Германия). Посеянным клеткам давали возможность осесть в течение 12 часов перед добавлением новой питательной среды. Среду для выращивания меняли каждые 24 часа до тех пор, пока клетки не достигли слияния <95%, обычно в течение 6-7 дней.

STEC EDL933 был использован в качестве модельного кишечного патогена.EDL933 является изолятом серотипа O157: H7, первоначально выращенного из говяжьего фарша из Мичигана и связанного с множественной вспышкой геморрагического колита в США (Riley et al., 1983; любезно предоставлено доктором T. Shimizu). Все эксперименты с этим штаммом проводились на объектах, лицензированных Центром биозащищенности и биоподготовленности в соответствии с датским законом о биобезопасности (Закон № 474, 2008 г.).

Зеленый флуоресцентный EDL933 был получен путем трансформации плазмидой pMAN01, содержащей ген устойчивости к хлорамфениколу.Плазмида pMAN01 была сконструирована путем лигирования рестрикционного фрагмента EcoRV-SapI, содержащего транскрипционное слияние гена gfp + с промотором hsp60, полученным из pMN402 (Scholz et al., 2000), в pBAD33. Полученная плазмида кодирует сильную конститутивную экспрессию репортерного белка GFP +. Бактерии выращивали в бульоне Luria (Invitrogen, Miller’s LB Broth Base) с добавлением 30 мг / л хлорамфеникола (Sigma-Aldrich) при 37 ° C в течение ночи (ON) по 2-дневному режиму без встряхивания.Вкратце, 10 мкл культуры стационарной фазы добавляли в новый флакон после одной ночи инкубации, а затем вторую культуру ON использовали в качестве затравочной суспензии в проточных камерах. Для роста STEC в проточных камерах была составлена ​​модифицированная минимальная среда M9 в соответствии с Эльбингом и Брентом (2002) со следующими компонентами, добавленными в каждый литр дистиллированной воды: 6,0 г динатрийфосфата, 3,0 г монокалиевого фосфата, 1,0 г хлорида аммония, 0,5 г хлорида натрия, 2,0 г D-глюкозы, 1.0 г гидролизата казеина, 0,5 мг гидрохлорида тиамина (все от Sigma-Aldrich), 4,0 мг хлорида кальция · 2H ₂ O, 0,228 г сульфата магния · 6H ₂ O (оба от Riedel-de Häen AG). Смесь растворяли, pH доводили 5 М соляной кислотой до 6,6 (аналогично фекалиям; Rose et al., 2015) и стерильно фильтровали при 0,2 мкм перед использованием.

Инфекция распространенного кровотока: Staphylococcus aureus Колонизация слоев эндотелиальных клеток (EA.hy926)

Слои, культивируемые в проточной камере, линии EA эндотелиальных клеток человека.hy926 был использован для моделирования эндотелиальной поверхности, а Staphylococcus aureus ATCC 29213 был использован в качестве модельного патогена кровотока. Линия эндотелиальных клеток EA.hy926 (ATCC CRL-2922) представляет собой иммортализованное слияние эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) и клеток аденокарциномы легких человека A549. Клетки EA.hy926 культивировали в среде DMEM, содержащей 4,5 г / л D-глюкозы, 584 мг / мл L-глутамина, 110 мг / л пирувата натрия (Gibco) с добавлением 10% FBS и 1% PS в колбах для культивирования клеток T25. при 37 ° C с 5% CO ₂ .Клетки EA.hy926 высвобождали снизу путем трипсинирования и субкультивировали при достижении 80% конфлюэнтности. 150 мкл 5 мл разделенных клеток повторно высевали в предметные стекла проточной камеры (μ-Slide I ^0,6 Luer Collagen IV, Ibidi, Germany). Чтобы клетки EA.hy926 достигли 100% слияния, камерные культуры инкубировали в течение 2 дней при 37 ° C с 5% CO ₂ . На второй день камеры были подключены к перистальтическому насосу и подвергались воздействию непрерывного потока клеточной среды (DMEM / 10% FBS) со скоростью 92 мкл / мин до следующего дня, чтобы позволить клеточному слою адаптироваться к условиям потока и промыть. антибиотики.Для всех экспериментов использовали вариант штамма S. aureus ATCC 29213, который конститутивно экспрессирует GFP под контролем стафилококкового blaZ-промотора (щедро предоставленного доктором Олегом Крутом Шнайтом и др., 2007). Перед заражением gfp -трансформированный S. aureus ATCC 29213 выращивали в стерильном фильтрованном триптико-соевом бульоне (TSB, Sigma), содержащем 30 мг / л хлорамфеникола, в течение 2½ часов при 37 ° C со встряхиванием для достижения экспоненциальной фазы. при которых экспрессия адгезинов повышена (Novick, 2003).Бактерии осаждали центрифугированием при 2000 g в течение 2 минут и ресуспендировали в 10% гепаринизированной плазме человека в течение 10 минут. Этот этап был выполнен для покрытия бактерий факторами свертывания крови человека и другими белками плазмы, таким образом имитируя опсонизацию / адсорбцию белка in vivo, , когда S. aureus попадает в кровоток. Затем суспензию еще раз центрифугировали при 2000 g в течение 2 минут и повторно суспендировали в 0,9% буфере NaCl до OD _{600 нм} 0.02. Аликвоту 700 мкл переносили в 69,3 мл DMEM / 10% FBS и использовали непосредственно в качестве посевной суспензии, что соответствует общему посевному материалу приблизительно 1,4 × 10 ⁷ КОЕ.

Инфекция мочевыводящих путей: уропатогенная Escherichia coli Колонизация слоев уроэпителиальных клеток (HTB9)

В качестве уроэпителиальных клеток использовали клеточную линию ATCC HTB9, субкультивированную в колбах T25 при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO. ₂ с использованием среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Gibco) с добавлением 10% FBS. и 1% PS в качестве питательной среды.Линия уроэпителиальных клеток ATCC HTB9 представляет собой бессмертную клеточную линию, полученную из карциномы мочевого пузыря человека. В качестве модели UPEC использовался штамм Escherichia coli UTI89, изолят серотипа O18: K1: H7, вызванный циститом, ранее использованный в нескольких исследованиях in vitro и in vivo на модели инфекции мочевыводящих путей (UTI) (Mulvey et al., 2001; Justice et al., 2004, 2006). Мутант с делецией UTI89Δ fimH был сконструирован, как сообщалось ранее (Andersen et al., 2012). Зеленые флуоресцентные варианты UTI89wt и UTI89Δ fimH были сконструированы путем трансформации плазмидой pMAN01, как описано выше для STEC EDL933. Для предварительного культивирования и роста UTI89 в проточных камерах использовалась искусственная моча (AU) в составе согласно Бруксу и Кивилу (1997). Вкратце, в каждый литр дистиллированной воды были добавлены следующие компоненты: 1,3 г хлорида аммония, 0,4 г лимонной кислоты, 2,1 г бикарбоната натрия, 5,2 г хлорида натрия, 10 г мочевины, 5 мг экстракта дрожжевого экстракта (все от Sigma-Aldrich. ), 0.37 г хлорида кальция · 2H ₂ O, 0,454 г сульфата магния · 6H ₂ O (оба от Riedel-de Häen AG), 3,2 г сульфата натрия · 10H ₂ O, 1,2 г дикалий гидрофосфата (оба из Merck), 0,454 г сульфата железа II · 6H ₂ O, 92 мкл молочной кислоты (оба из VWR), 0,8 г креатинина (Alfa Aesar), 1 г пептона L37 (Oxoid), 0,95 г дигидрофосфата калия (Fluka Chemika) и 0,07 г мочевой кислоты (AppliChem). Смесь доводили до pH 6,4 с помощью 5 M соляной кислоты и стерилизовали фильтрованием перед использованием.Мы рекомендуем хранить раствор в пластиковых контейнерах, так как хранение в стеклянных контейнерах может вызвать осаждение раствора по неизвестным причинам. Перед посевом в проточные камеры UTI89 предварительно культивировали в двухдневном режиме либо в бульоне Лурия (для стимуляции экспрессии T1F), либо в AU (для моделирования физиологических условий). Первоначальную культуру ON получали инокулированием колонии на чашке с агаром в 35 мл конкретной среды. На следующий день 10 мкл переносили в новый флакон со средой на 35 мл и инкубировали ON.

Инфекция клеточных слоев в проточной камере

Инфекции проточной камеры проводили в коммерческих проточных камерах типа Ibidi μ-slide ^0,6 (Ibidi, Германия). Бактериальные штаммы, использованные в экспериментах, представлены в таблице 1.

Таблица 1 . Штаммы, использованные в исследовании.

В экспериментах с клетками T84 и HTB9 клетки выращивали до слияния в проточных камерах в статических условиях, как описано выше. Затем камеры были подключены к перистальтическому насосу (Ismatec IPC-N8, Glattbrugg, Швейцария) через стерильные силиконовые пробирки, и постоянный поток полной питательной среды составлял 200 мкл / мин в течение 2 дней при 37 ° C и 5% CO _{. 2} .При применении потока примерно 50% клеток смываются и медленно заменяются более устойчивым к потоку слоем клеток, который в конечном итоге достигает> 95% слияния в течение 2 дней. Перед заражением проточные камеры отсоединяли от насоса, и клетки промывали 10 раз сбалансированным солевым раствором Хэнка с добавлением хлорида кальция и хлорида магния (HBSS, Gibco) для удаления любых белков, полученных из среды. Затем клетки фиксировали инкубированием без протока в течение 1 ч в 10% нейтральном забуференном растворе формалина (Sigma, номер продукта HT-5011) при 37 ° C и 5% CO ₂ и затем промывали еще 10 раз в HBSS для удаления формалин из проточных камер.Затем проточные камеры снова подсоединяли к насосу, и оставшийся формалин вымывали со скоростью 200 мкл / мин в течение 30 минут в проточной среде, используемой для последующих экспериментов по заражению. Затем клеточные слои инфицировали путем перфузии проточных камер бактериями, суспендированными в фосфатно-солевом буфере (PBS) (SSI Diagnostica) до оптической плотности (OD ₆₀₀ ) 0,2, что соответствует приблизительно 1,6 × 10 ⁸ КОЕ / мл. . Посевную суспензию пропускали через камеры со скоростью 100 мкл / мин в течение 20 минут, как описано ранее (Stærk et al., 2016). Затем к камере подсоединяли селективную среду (модифицированные M9 и AU, соответственно, с хлорамфениколом 30 мг / л для стабильности плазмиды pMAN01), и прилипшим бактериям позволяли колонизировать клеточный слой в течение 24 часов при скорости потока 50 мкл / мин (модифицированный M9 ) и 200 мкл / мин (AU) для изолятов STEC и UPEC соответственно.

При инфицировании S. aureus слоев клеток EA.hy926 бактериальную посевную суспензию (см. Выше) пропускали через камеру в течение 10 мин при скорости потока 6.4 мл / мин. Затем к камере были подключены новые стерильные пробирки, и в течение оставшегося времени эксперимента стерильная среда DMEM с 10% FBS прокачивалась через камеры в режиме последовательного потока, состоящего из 1 мин при расходе 6,4 мл / мин с прерыванием на 9 мин. пауза, перезапуск каждые 10 мин.

Количественная оценка поверхностной колонизации с помощью анализа изображений

Колонизацию проточных камер контролировали с помощью автоматической покадровой флуоресценции и фазово-контрастной микроскопии. С помощью микроскопа BX51 и программного обеспечения Olympus cellSens (версия 1.7) случайным образом было выбрано 11 отдельных положений в каждой проточной камере с общей площадью поверхности 10,23 мм ² . Затем эти позиции были назначены диспетчеру экспериментов cellSens, и программное обеспечение было запрограммировано на последовательную съемку флуоресцентных изображений (GFP) и фазово-контрастных изображений всех 11 позиций каждые 20 минут в течение заранее определенного количества циклов. После завершения покадровой записи флуоресцентные изображения были проанализированы с помощью инструмента CellSens Count and Measure с использованием интервальных стробов для захвата флуоресцентных бактерий и исключения фонового сигнала.Покрытие в процентах было определено как значения области интереса (ROI). Графики развития бактериальной колонизации представляют средние значения от 3 до 4 отдельных экспериментов с проточной камерой ± одно стандартное отклонение (SD).

Статистический анализ

Тест суммы рангов Уилкоксона использовали для сравнения значений ROI UTI89wt, предварительно культивированного в LB, с UTI89wt, предварительно культивированным в AU, и UTI89Δ fimH , предварительно культивированным в LB. Используя поправку Бонферрони для 8 сравнений, p <0.006 (0,05 / 8) считались статистически значимыми. 95% доверительные интервалы (ДИ) были получены с использованием анализа начальной загрузки 10 ⁵ повторов. Все анализы были выполнены в STATA версии 15.0 (StataCorp LLC, College Station, TX, USA).

Результаты

Экспериментальная установка

На рис. 1 показан эскиз экспериментальной установки. Для оптимальных условий культивирования клеток вся установка помещается в инкубатор CO ₂ . Проточные камеры размещаются на высокоточном моторизованном предметном столике с компьютерным управлением под микроскопом.Получение изображений сконфигурировано для захвата изображений каждые 20 минут в 11 предварительно заданных местах в канале потока для получения репрезентативных средних значений прогрессии колонизации. После посева бактерий применяют стерильный прямоточный поток, чтобы специально контролировать способность первоначально засеянных бактерий увеличиваться в количестве на поверхности в условиях потока жидкости.

Рисунок 1 . Схема, показывающая экспериментальную установку, используемую для изучения бактериальной колонизации клеточных слоев.Применяется прямоточная установка со стерильной средой (A), , прокачиваемой через проточную камеру (B), с использованием высокоточного перистальтического насоса, расположенного после проточной камеры (C) . Проточная камера помещается на управляемый компьютером, моторизованный столик под микроскопом (D) , что позволяет регистрировать изображение инфицированного клеточного слоя (E) . Заранее определенные местоположения на слое клеток (F) контролируются с помощью покадровой фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии, с последующим извлечением данных и компьютерной обработкой кривых роста (G) .Вся установка хранится в инкубаторе для контроля температуры и уровней CO ₂ .

В текущих экспериментах данные регистрировались за периоды времени от 24 до 26 часов и включали измерения количества и площади отдельных микроколоний, а также общий охват в процентах (ROI-%). На основании параллельных количественных оценок КОЕ на начальных этапах инфекции предел обнаружения был оценен примерно в 10 ⁶ бактерий на камеру, и обнаруживаются только сгруппированные бактерии на стадии микроколонии.

STEC Колонизация слоев эпителиальных клеток кишечника

Колонизация кишечника прототипическим STEC серотипа O157: штамм H7 EDL933 моделировали с использованием клеточных слоев линии клеток T84 (рис. 2). Было обнаружено, что живые клетки T84 быстро дестабилизируются при заражении EDL933, вероятно, в результате секреции токсина Shiga посредством EDL933. Следовательно, в этой модели инфекции в качестве субстрата использовались фиксированные формальдегидом клеточные слои Т84. В качестве питательной среды использовали простую среду на основе М9 с добавлением глюкозы и казеина.Никакая питательная среда идеально не отражает фекалии из-за ее высокогетерологичного состава. Вместо этого мы выбрали эту относительно нейтральную среду, которая не содержит нерелевантных компонентов животного или дрожжевого происхождения. В то же время эта среда очень прозрачна, что обеспечивает высокое отношение сигнал / шум при регистрации сигналов флуоресценции из камеры.

Рисунок 2 . Колонизация штамма STEC EDL933 на фиксированных слоях эпителиальных клеток кишечника Т84 под током. (A) График, показывающий развитие бактерий на поверхности.Точки данных представляют собой средние значения бактериального покрытия в процентах с 20-минутными интервалами для четырех отдельных прогонов проточной камеры. Планки погрешностей представляют ± 1 стандартное отклонение между отдельными прогонами проточной камеры (показаны для ясности только с 1-часовыми интервалами). Значения в каждый 20-минутный момент времени, полученные при каждом запуске проточной камеры, представляют собой средние значения из записей в 11 положениях, каждое из которых представляет 1100 × 850 мкм на поверхности слоя клеток. График основан на 2 684 отдельных сканированиях. (B – D) Примеры данных изображения, записанных в одной репрезентативной позиции кадрирования 380 × 250 мкм.Фазово-контрастная микроскопия (Bi – Biv) , флуоресцентная микроскопия (Ci – Civ) и обнаруживаемое программным обеспечением покрытие (Di – Div) показаны в четырех конкретных временных точках. Эти временные точки отмечены пунктирными линиями в (A) , представляющими четыре фазы поверхностной колонизации; посев (½ ч; Bi , Ci , Di ), начальное укоренение на поверхности (5 ч; Bii , Cii , Dii ), стабилизация на поверхности (9 ч; Biii ) , Ciii , Diii ) и в установившемся режиме (17 ч; Biv , Civ , Div ).GFP, зеленый флуоресцентный белок; ч, часы; PH, фазово-контрастная микроскопия; ROI, регион интереса.

Спустя примерно 3 часа после инфицирования (hpi) рост EDL933 на слоях клеток T84 быстро увеличивался до значения ROI примерно 50% при 6 hpi. Как показано на фиг. 2B – D, рост начинается в виде спорадических микроколоний, диспергированных на слое клеток T84, которые медленно увеличиваются в размере, наконец приобретая вид биопленки. Начиная с 6 hpi и далее, более крупные комки материала биопленки иногда смываются с клеточного слоя, что приводит к кратковременному падению процента ROI во время эксперимента и более высоким значениям SD (Рисунок 2A, Рисунок S1).Это удаление материала биопленки временно замедляет рост до 17hpi, после чего рост стабилизируется почти на 100%.

Спорадический рост на поверхности привел к значительным отклонениям в покрытии биопленкой между микроскопическими изображениями, полученными во время фазы роста биопленки (отдельные проточные камеры проходят с полосами ошибок SD, указывающими на отклонение между отдельными захваченными изображениями, показаны на рисунке S1). Это подчеркивает необходимость извлечения средних значений из нескольких изображений в каждой проточной камере для оптимальной точности.Кривые кривых средних значений из отдельных прогонов были относительно схожими между экспериментами, демонстрируя воспроизводимость метода (рисунок S1 и обозначены полосами SD-ошибок на рисунке 2A).

Staphylococcus aureus Колонизация слоев эндотелиальных клеток

Метастатическая инфекция кровотока возникает, когда патогены кровотока распространяются через сосудистую систему и достигают отдаленных эндотелиальных или эндокардиальных участков. Здесь патогену удается прочно прикрепиться к эндотелию / эндокарду, несмотря на значительный сдвиг жидкости, за которым следует пролиферация и вторжение в подлежащую ткань (Edwards et al., 2010). Здесь мы установили экспериментальный протокол, основанный на установке количественной оценки флуоресцентной микроскопии, для мониторинга и количественной оценки адгезии и начальной колонизации слоев эндотелиальных клеток S. aureus в потоке жидкости. В качестве модельного патогена кровотока использовали штамм 29213 S. aureus ATCC и моделировали стенку сосуда / поверхность клапана сердца с использованием слоев эндотелиальных клеток EA.hy926, культивированных в проточной камере. Перед инфицированием S. aureus ATCC 29213 кратковременно обрабатывали плазмой крови человека для стимуляции опсонизации и белковой оболочки плазмы, которая образует in vivo (Ko et al., 2013; Claes et al., 2014). В качестве проточной среды использовали DMEM в 10% FBS для обеспечения источника белков крови, включая фибронектин, который важен для взаимодействия S. aureus с эндотелием (Edwards et al., 2010). Кроме того, использование этой среды позволяло проводить экспериментальную инфекцию как совместное культивирование с живыми слоями эндотелиальных клеток на протяжении всего эксперимента.

Моделирование напряжения сдвига сосудистой стенки требует высоких скоростей потока. В текущем эксперименте с инфекциями такое напряжение сдвига не может быть создано путем рециркуляции среды, так как это быстро приведет к неконтролируемому и непрерывному высеванию бактерий в камере, а также к быстрому истощению питательных веществ и накоплению отходов циркулирующие питательные среды.С другой стороны, использование непрерывного прямоточного потока при высоких скоростях потока неизбежно приводит к огромному расходу дорогостоящих сред в длительных экспериментах по заражению. В качестве компромисса мы решили использовать последовательный прямоточный поток, состоящий из 1 мин высокого потока (6,4 мл / мин), что дает напряжение сдвига стенки 2,77 дин / см ² , прерываемое паузой в 9 минут, с последующим перезапуском цикла. Напряжение сдвига 2,77 дин / см ² находится в пределах скоростей, обнаруживаемых в большом венозном и артериальном кровообращении (приблизительно от 1 до 12 дин / см ² ; Papaioannou and Stefanadis, 2005).Несмотря на периоды отсутствия потока, периодическая последовательность высоких потоков гарантирует, что бактерии все еще будут вынуждены устанавливать контакт с поверхностью с такой же силой адгезии, как если бы использовался непрерывный поток.

При применении этого экспериментального протокола для изучения и количественной оценки адгезии и колонизации S. aureus на эндотелии, мы обнаружили, что бактерия проявляла значительную задержку в инициации поверхностной колонизации. Как показано на Рисунке 3, первые бактериальные колонии обнаруживаются через 12-15 hpi.Задержка колонизации поверхности одинакова между прогонами; однако кривые роста из отдельных прогонов проточной камеры показывают случайные большие падения общего покрытия в каждой камере в результате высвобождения больших комков биопленки после того, как они накапливаются на поверхности (для отдельных прогонов см. графики на Рисунке S2). Еще более выраженным для S. aureus по сравнению с STEC является спорадический рост, который происходил только в относительно небольшом количестве участков на эндотелиальной поверхности (данные не показаны).

Рисунок 3 . S. aureus Колонизация ATCC 29213 на живых слоях эндотелиальных клеток EA.hy926 под током. (A) График, показывающий прогрессирование роста бактерий на поверхности с точками данных, представляющими средние значения бактериального покрытия в процентах с 20-минутными интервалами из трех отдельных прогонов проточной камеры. Столбики ошибок представляют собой ± 1 стандартное отклонение между прогонами отдельных проточных камер (показаны для ясности с интервалом в 1 час). Значения в каждый 20-минутный момент времени, полученные при каждом запуске проточной камеры, представляют собой средние значения из записей в 11 положениях, каждая из которых представляет 1100 × 850 мкм на поверхности слоя клеток (на этом графике данные основаны на в общей сложности 2607 отдельных сканированиях). (Б – Д) . Пример данных изображения, записанных в одной позиции, представляющий обрезанную область размером 380 × 250 мкм с ростом выше среднего. Фазовый контраст — (Bi – Biv) , флуоресцентная микроскопия (Ci – Civ) и покрытие, определяемое программным обеспечением (Di – Div) , показаны в четырех конкретных временных точках (отмечены пунктирными линиями в A ) . GFP, зеленый флуоресцентный белок; ч, часы; PH, фазово-контрастная микроскопия; ROI, регион интереса.

S. aureus известен как высокоинвазивный, и вполне вероятно, что некоторая степень внутриклеточной колонизации присутствует в живых EA.слой клеток hy926, также на начальном этапе. Однако такие сигналы не улавливаются камерой микроскопа, возможно, из-за предела обнаружения примерно 10 ⁶ КОЕ / камеру.

UPEC Колонизация слоев уроэпителиальных клеток

В предыдущих исследованиях мы исследовали взаимодействие UPEC со слоями уроэпителиальных клеток в проточных системах (Khandige et al., 2016; Stærk et al., 2016). Этот предыдущий подход позволил провести качественный микроскопических анализов in situ бактериальных фенотипов на клеточных слоях.Однако у него отсутствовала возможность количественно оценить способность бактерий прикрепляться к поверхности клеточного слоя и колонизировать ее при воздействии значительного сдвига жидкости. Здесь мы применили метод количественной оценки на основе флуоресценции для получения таких измерений. Искусственная моча (AU) использовалась в качестве проточной среды при скорости потока 200 мкл / мин, соответствующей напряжению сдвига стенки 0,08 дин / см ² (скорость сдвига = 12,02 с ^-1 ). Это примерно в шесть раз выше, чем значение, использованное в более ранних исследованиях (2 с ^-1 , Andersen et al., 2012; Khandige et al., 2016; Stærk et al., 2016), и применяется в текущей модели, чтобы позволить прочности адгезии быть основным ограничивающим фактором для колонизации, что позволяет различать UPEC с недостатками адгезии / колонизации. Слои уроэпителиальных клеток в модели, продемонстрированной здесь, были зафиксированы до инфекции, чтобы сохранить полностью слившийся слой клеток во время инфекции и контролировать адгезию и поверхностную колонизацию без влияния клеточных инвазивных событий.

Подобно EDL933, UTI89 демонстрирует начальную лаг-фазу (рисунок 4).Однако, как только UTI89 начинает рост, охват увеличивается с высокой экспоненциальной скоростью, пока не приблизится к 100%. В отличие от биопленок S. aureus ATCC 29213 и STEC EDL933, биопленка UPEC UTI89 оказалась очень стабильной с потерей биомассы в основном в виде планктонной формы отдельных бактерий, а не скоплений биопленки (на основе анализа покадровой микроскопии). развитие биопленки). Из-за эффективного засева наблюдался относительно равномерно распределенный рост UPEC по всей поверхности, что приводило к небольшому отклонению между изображениями, полученными в отдельных прогонах проточной камеры (обозначено полосами ошибок SD на рисунке 4).Разброс между отдельными прогонами в проточной камере был очень низким, что свидетельствует о хорошей воспроизводимости.

Рисунок 4 . Колонизация штамма UPEC UTI89 на фиксированных слоях уроэпителиальных клеток HTB9 в потоке искусственной среды мочи. Четыре отдельных прогона проточной камеры показаны вместе, чтобы визуализировать высокую степень воспроизводимости от эксперимента к эксперименту. В каждой проточной камере наблюдали за одиннадцатью участками размером 1100 × 850 мкм в течение 24 часов. Планки погрешностей указывают ± 1 стандартное отклонение. ROI, регион интереса.

Оценка роли адгезии, опосредованной фимбриями 1 типа, в колонизации UPEC слоев уроэпителиальных клеток

T1F и его концевой адгезин FimH являются одними из наиболее всесторонне изученных факторов вирулентности UPEC и, как полагают, способствуют уроэпителиальной адгезии и колонизации мочевыводящих путей человека. Исследования показали, что T1F облегчает адгезию к уроэпителиальным клеткам человека и увеличивает вирулентность in vivo , на основании статических анализов клеточной адгезии и моделей инфицирования мышей (Connell et al., 1996; Райт и др., 2007). Однако сообщенная низкая экспрессия fim генов in vivo поднимает вопросы о регуляции и важности T1F во время ИМП (Lim et al., 1998; Hagan et al., 2010).

Для оценки влияния T1F-опосредованной адгезии на способность UTI89 колонизировать уроэпителий в условиях, отражающих среду мочевыводящих путей, штамм UTI89, удаленный в гене fimH (без функционального T1F), был проанализирован с использованием текущего метода и по сравнению с UTI89wt / pMAN01.Этот результат показал резкое влияние T1F на способность UPEC устанавливать контакт и колонизировать уроэпителий (рис. 5). Начало колонизации UTI89Δ fimH откладывается примерно на 6 часов по сравнению с UTI89wt (предварительно культивированный LB), и как только начинается рост, UTI89Δ fimH демонстрирует примерно в 18 раз большее время удвоения площади поверхности с окончательным охватом, достигающим только приблизительно 57 % через 24 часа (рисунок 5 и таблица 2).

Рисунок 5 .Колонизация UPEC UTI89 на фиксированных слоях уроэптелиальных клеток HTB9 под током. (A) График, показывающий прогрессирование бактериального роста на поверхности посредством UTI89wt, предварительно культивированного в LB (красная линия), UTI89wt, предварительно культивированного в AU (зеленая линия), и UTI89Δ fimH , предварительно культивированного в LB (синяя линия) ). Точки данных представляют собой средние значения бактериального покрытия в процентах с 20-минутными интервалами для трех отдельных прогонов проточной камеры. Столбики ошибок представляют собой ± 1 стандартное отклонение между прогонами отдельных проточных камер (показаны для ясности с интервалом в 1 час).Значения в каждый 20-минутный момент времени, полученные при каждом запуске проточной камеры, представляют собой средние значения из записей в 11 положениях, каждая из которых представляет 1100 × 850 мкм на поверхности клеточного слоя (на графике данные собраны из 8640 отдельных сканирований). (B – D) Пример данных изображения, записанных в одной репрезентативной позиции кадрирования 380 × 250 мкм. Фазовый контраст ( Bi – Biv, Ei – Eiv, Hi – Hiv ), флуоресцентная микроскопия ( Ci – Civ, Fi – Fiv, Ii – Iiv ) и покрытие, определяемое программным обеспечением ( Di – Div, Gi – Giv , Ji – Jiv ) показаны в четырех конкретных временных точках.Они отмечены пунктирными линиями в (A) , представляющими различные фазы поверхностной колонизации. Покрытие UTI89wt, предварительно культивированного в LB и AU, значительно различается через 5 и 9 часов после посева ( p <0,001, отсутствие перекрытия 95% ДИ). Покрытие UTI89wt и UTI89Δ fimH значительно различается через 5, 9 и 17 часов после посева ( p <0,001, отсутствие перекрытия 95% ДИ). GFP, зеленый флуоресцентный белок; ч, часы; PH, фазово-контрастная микроскопия; ROI, регион интереса.

Таблица 2 . Математические модели роста биопленки в экспоненциальной фазе.

В предыдущих исследованиях мы и другие продемонстрировали, что UTI89 и другие штаммы UPEC, выращенные планктонно в моче, демонстрируют очень низкую экспрессию T1F (Lim et al., 1998; Roos et al., 2006; Reisner et al., 2014; Greene et al. ., 2015; Stærk et al., 2016). В этом более раннем исследовании мы обнаружили, что низкий уровень T1F-положительных бактерий в моче существенно не влияет на способность UPEC образовывать биопленку на материале катетера (Stærk et al., 2016). Здесь мы хотели оценить, влияет ли низкий уровень T1F-положительного UPEC в моче на способность UPEC инициировать поверхностную колонизацию уроэпителия.

UTI89wt предварительно культивировали в искусственной моче (AU), что приводило в основном к T1F-отрицательным бактериям, аналогичным культивированию в реальной моче (данные не показаны). Затем эти бактерии высевали на слои клеток HTB9 в проточной установке и позволяли колонизировать поверхность в потоке AU. На фигуре 5А показано, что предварительно культивированный AU UTI89 значительно подавлен в своей способности колонизировать поверхность уроэпителия с отсроченным началом колонизации и в 3 раза более длительным временем удвоения площади после перехода роста в экспоненциальную фазу (таблица 2).В конце концов, предварительно культивированная популяция AU закрепляется и, наконец, достигает примерно 100% покрытия поверхности примерно через 14 часов.

В таблице 2 показаны наклоны функций наилучшего соответствия, описывающих кривые роста для трех препаратов UPEC, проанализированных на рисунке 5A (см. Рисунок S3 для линий, соответствующих ln-преобразованным данным). Различие в кинетике колонизации отражает различные ограничения способности бактерии увеличивать свою биомассу, связанную с поверхностью, в применяемых условиях.Быстрое время удвоения площади для UTI89wt, предварительно культивированного в LB, вероятно, в основном ограничено скоростью его репродукции, поскольку дочерние клетки в значительной степени удерживаются на поверхности за счет прочного T1F-опосредованного поверхностного закрепления. В результате получается кривая роста, напоминающая обычное культивирование в бульоне. С другой стороны, колонизация и наращивание биопленки, демонстрируемые UTI89Δ fimH , почти уравновешиваются значительной потерей дочерних клеток в поток, что приводит к очень медленному увеличению биомассы, связанной с поверхностью.

Эффективность посева бактерий

Способность бактерии эффективно закрепляться на данной поверхности под воздействием сдвигового напряжения жидкости зависит от ее способности изначально прилипать к поверхности, а также от способности прикрепившихся бактерий размножаться на поверхности (колонизация). Последнее зависит от баланса между размножением на поверхности и потерей бактериальных клеток в поток.

Поскольку микроскопический мониторинг роста в представленной установке подсчитывает отдельные события (микроколонии), записанные данные можно использовать для оценки того, насколько эффективно данная бактерия прилипает к поверхности и образует микроколонии на начальной стадии.На рисунке 6 показано количество событий, подсчитанных во время фаз роста различных бактерий и бактериальных препаратов, проанализированных в текущем исследовании. UTI89wt, предварительно культивированный в LB, показал очень эффективный посев, достигая средних значений более 1600 микроколоний на контролируемый участок вскоре после посева, число, которое впоследствии уменьшается из-за слияния колоний (рис. 6А). T1F-отрицательный UTI89wt, предварительно культивированный в AU, достиг лишь примерно половины числа прикрепленных микроколоний на своем пике по сравнению с UTI89wt, предварительно культивированным в LB.Меньшее количество микроколоний, образовавшихся первоначально, и задержка начала роста объясняют более медленную скорость колонизации UTI89wt в применяемых условиях. Связанная с поверхностью биомасса, генерируемая UTI89Δ fimH , возникает из еще меньшего количества первоначально прикрепившихся бактерий. Более того, они демонстрируют более медленное увеличение роста, вероятно, вызванное значительной потерей дочерних клеток в поток, что приводит к низкой общей эффективности посева во время установления биопленки.

Рисунок 6 . Эффективность бактериального посева. Графики, показывающие среднее общее количество микроколоний (событий), обнаруженных в подобластях 1100 × 850 мкм в каждую 20-минутную временную точку во время экспериментов по заражению тремя различными патогенами. Данные для каждого типа экспериментов были объединены из всех проведенных экспериментов с проточной камерой. Пики указывают на максимальное количество бактерий, которым удается создать микроколонию после первоначального посева. (A) Штаммы UPEC UTI89wt и UTI89Δ fimH , выращенные на слоях уроэпителиальных клеток в потоке искусственной мочи (AU).UTI89wt предварительно культивировали в AU или LB перед экспериментом, как указано. (B) Рост STEC на эпителиальных клетках кишечника (T84). (C) Колонизация S. aureus на слоях эндотелиальных клеток (EA.hy926).

Штамм STEC EDL933 создал примерно такое же количество микроколоний, что и UTI89wt, предварительно культивированный в LB, но достиг пика в более поздний момент времени после заражения. Кроме того, большое количество обнаруженных микроколоний сохранялось в течение более длительного периода времени по сравнению с UTI89wt, предварительно культивированным в LB.Это указывает на трудности, с которыми сталкивается эта бактерия при формировании стабильных биопленок со слиянием микроколоний в применяемых условиях. В целом STEC EDL933 показал промежуточную эффективность посева. Лишь немногие бактерии S. aureus ATCC29213 были способны прилипать и инициировать пролиферацию в применяемых условиях высокой скорости потока (рис. 6С), при этом относительно небольшое количество колоний расположено слишком далеко друг от друга, чтобы эффективно слиться в биопленку в течение 24 часов.

Обсуждение

Необратимое прикрепление и пролиферация на эпителиальных поверхностях барьера хозяина является важным первым шагом в патогенезе многих инфекционных заболеваний (Finlay and Falkow, 1997; Pizarro-Cerdá and Cossart, 2006; Ribet and Cossart, 2015).Инвазия на участки слизистой оболочки требует, чтобы бактерия прочно прилегала к поверхностным слоям клеток и увеличивалась в количестве, сопротивляясь непрерывному движению жидкостей на этих участках. Для точного моделирования этого процесса in vitro требуется система, которая позволяет бактериям взаимодействовать с соответствующими слоями эпителиальных клеток человека в контролируемых гидродинамических условиях и в соответствующих средах.

Исследования адгезии бактерий к эпителиальным клеткам обычно проводят с культивированными клеточными линиями на микротитровальных планшетах (Albert et al., 2000). Однако в последние годы исследования адгезии, проводимые в проточных устройствах, начали набирать обороты. Такие анализы позволяют лучше контролировать напряжение сдвига жидкости, а также контролировать процесс адгезии с помощью микроскопии. Область, в которой этот подход нашел все более широкое применение, — это анализ взаимодействия между патогенами кровотока и эндотелиальными клетками. Здесь моделирование физиологических условий потока во время бактериальной адгезии значительно расширило понимание патогенеза этого типа инфекции (Pappelbaum et al., 2013; Liesenborghs et al., 2016; Claes et al., 2017). Что касается диссеминированных инфекций S. aureus , инфекции, вызываемые Escherichia coli , обычно развиваются в местах, где необходимо преодолеть значительное напряжение сдвига жидкости, чтобы бактерия могла успешно заразить хозяина. Изучая адгезию бактерий и клеток-хозяев в модели потока, Томас и его коллеги обнаружили, что основной адгезин E. coli , FimH, функционирует как датчик силы, который увеличивает силу адгезии к уроэпителию, когда бактерия подвергается сдвигу жидкости (Thomas и другие., 2002). Бактериальная адгезия в проточных моделях также использовалась, чтобы показать, что Borrelia burgdorferi прилипает к эндотелию и отделяется от него под действием потока подобно лейкоцитам, катящимся по сосудистой стенке (Ebady et al., 2016), и что это прикрепление включает рекрутирование фибронектина, тем самым связывая бактерии с эндотелиальной стенкой (Niddam et al., 2017). Кроме того, было показано, что адгезия Neisseria meningitidis к эндотелиальным клеткам зависит от вызванного бактериальным ворсом IV ремоделирования эндотелиальной плазматической мембраны, позволяющего бактериям противостоять силам сдвига сосудов (Mikaty et al., 2009; Soyer et al., 2014).

Вышеупомянутые исследования начальной адгезии ясно демонстрируют важность введения физиологически релевантного потока жидкости в исследованиях взаимодействия бактерий и эпителия. Хотя начальная адгезия имеет решающее значение, способность бактерии увеличиваться в количестве на поверхности слизистой оболочки является следующей проблемой, которую необходимо преодолеть для успешного установления инфекции. Чтобы смоделировать эти события, необходимы продолжительные эксперименты по заражению, и, особенно когда используются слои живых клеток человека, должна быть создана среда, в которой культура клеток человека будет жизнеспособной, несмотря на присутствие намного быстрее растущих бактерий.

Только в нескольких более ранних исследованиях сообщалось о моделях, позволяющих отслеживать имитацию эпителиальной инфекции в течение продолжительных периодов времени (часы). Mairey et al. и Soyer et al. продемонстрировали модели потока, используемые для изучения взаимодействия Neisseria meningitides со слоями эндотелиальных клеток в течение нескольких часов. Эта модель была использована для исследования адгезии, колонизации и последующего отсоединения от этих клеточных слоев, а также для изучения влияния напряжения сдвига на способность бактерии взаимодействовать с капиллярами мозга (Mairey et al., 2006; Soyer and Duménil, 2011 ) . Alsharif et al. недавно продемонстрировали модель кишечной инфекции STEC, в которой штамм STEC O157: H7 Sakai совместно культивировали на прикрепленных клетках HeLa в токе в течение до 4 часов, демонстрируя повышенную регуляцию генов центральной вирулентности в результате адгезии клеток-хозяев при сдвиге жидкости ( Alsharif et al., 2015 ) . Используя микрофлюидное устройство, Kim et al. сообщили о модели совместного культивирования клеток HeLa и STEC, которые были использованы для демонстрации того, что микроокружение биопленок комменсалов является ключевым фактором инфекционности STEC (Kim et al., 2010 ) . В недавно созданной модели, описанной Tremblay и соавторами, также использовалось микрофлюидное устройство для исследования способности различных патогенных E. coli колонизировать слои эпителиальных клеток кишечника (Tremblay et al., 2015 ) . В исследовании был продемонстрирован протокол, который поддерживал первоначальное образование микроколоний STEC на слое кишечных клеток в течение 16 часов и количественную оценку роста STEC на основе анализа изображений флуоресцентной микроскопии фиксированных слоев инфицированных клеток после завершения эксперимента.

Используя специально созданную установку проточной камеры, мы ранее продемонстрировали модель инфекции мочевыводящих путей с совместными культурами UPEC и уроэпителиальных клеток, что позволило нам воспроизвести основные элементы уропатогенеза E. coli , которые ранее наблюдались только у животных. модели (Andersen et al., 2012; Khandige et al., 2016).

В текущем исследовании мы демонстрируем экспериментальную методологию, которая позволяет проводить длительные анализы инфекции и прямую in situ количественную оценку прогрессирования бактериальной колонизации слоев эпителиальных клеток под током.Представлены три модели инфекции, две из которых используют фиксированные слои уроэпителиальных или кишечных клеток для моделирования UPEC и STEC инфекции мочевыводящих путей и кишечника, соответственно. Третья модель позволяет исследовать адгезию и колонизацию S. aureus на слоях живых эндотелиальных клеток в условиях высокого потока, тем самым моделируя ключевой этап диссеминированной инфекции кровотока. Методология была специально разработана для обеспечения точной и чувствительной оценки эффективности колонизации с течением времени и для лучшей оценки важности конкретных эндогенных или экзогенных факторов в способности бактериальных патогенов колонизировать типичные места входа в человеческий организм-хозяин.

Хотя STEC не является как таковым, считается образующим биопленку, он действительно содержит большое количество специфических генов, которые вносят вклад в поверхностную колонизацию и образование биопленок (Puttamreddy et al., 2010). В нашем исследовании мы обнаружили, что штамм STEC EDL933 действительно является твердым образующим биопленку, который эффективно колонизировал эпителиальный слой кишечника человека в течение 24-часового эксперимента. В данном случае использование фиксированных слоев клеток было необходимо для предотвращения опосредованного токсинами уничтожения клеточного слоя, однако стимулы адгезии, вероятно, все еще будут индуцироваться в бактериях, поскольку фиксированные клетки сохраняют значительное количество поверхностных антигенов (Yu et al., 2014). Однако следует подчеркнуть, что использование фиксированных слоев клеток обеспечивает только физиологическую поверхность субстрата для роста бактерий, без дальнейшего взаимодействия клетки-хозяина и бактерии, которое, как известно, происходит in vivo (Lai et al., 2013). При необходимости, исследования, посвященные этим событиям, например, бактериальной деградации эпителия, возможны с использованием вместо этого живых слоев эпителиальных клеток и подходящей клеточной среды. Это можно, например, комбинировать с регистрацией сигналов флуоресценции от репортерных штаммов генов вирулентности.

Модель должна быть полезна для выяснения влияния конкретных факторов вирулентности на эффективность кишечной колонизации, а также для исследований конкуренции с комменсальными бактериями или более клинически ориентированных исследований эффекта лечения антибиотиками. Последнее особенно важно в случае кишечной инфекции STEC, поскольку, как сообщается, лечение антибиотиками увеличивает риск гемолитико-уремического синдрома у пациентов с этим типом инфекции (Freedman et al., 2016). Здесь модель представляет собой подходящий инструмент in vitro для идентификации более подходящих схем лечения, которые в меньшей степени вызывают экспрессию генов вирулентности.

Эндотелиальную колонизацию S. aureus проводили с живыми эндотелиальными клетками с использованием DMEM + FBS в качестве проточной среды. Из-за содержания FBS эта среда содержит белки крови, которые используются S. aureus для адгезии, такие как фибронектин. Следует отметить, что мы получили предварительные результаты, показывающие, что этот метод можно проводить с живыми эндотелиальными клетками, используя разбавленную плазму человека в качестве единственного источника питательных веществ.Это обеспечивает еще более физиологически правильную среду, которая поддерживает рост S. aureus и жизнеспособность эндотелия, а также содержит фибриноген и компоненты коагуляции, которые используются S. aureus для образования тромботических биопленок (Grønnemose et al., 2017).

Представленная здесь модель уроэпителиальной инфекции была проведена с использованием линии уроэпителиальных клеток HTB9 и прототипа изолята цистита UTI89. Основываясь на морфологии, HTB9 представляет собой линию дифференцированных клеток на относительно конечной стадии, которая обеспечивает клеточный слой, который сильно поддерживает адгезию и инвазию UPEC (неопубликованные данные).Недостатком является то, что HTB9 относительно хрупок в условиях высокого потока и, следовательно, требует фиксации для использования в текущем анализе. Если для дальнейшего изучения взаимодействий UPEC-уроэпителий необходимы живые клетки, клеточную линию PD07i (Klumpp et al., 2001) можно использовать в анализах потока без фиксации, поскольку она более устойчива к потоку (Andersen et al., 2012) и остается сливаться после продолжительных экспериментов по инфекции в потоке мочи (Klein et al., 2015). PD07i, однако, является относительно недифференцированной клеткой, больше похожей на лежащие в основе уротелиальные клетки в многослойной слизистой оболочке мочевого пузыря и, вероятно, по этой причине, менее поддерживает адгезию / инвазию UPEC (собственные неопубликованные данные).Чтобы клетки PD07i находились в устойчивом к потоку недифференцированном режиме роста, его поддерживают в специальной и дорогой бессывороточной среде с низким содержанием кальция (Thumbikat et al., 2009), что значительно увеличивает затраты на эксперименты, особенно в условиях высокой скорости потока. используются. Следует также отметить, что эксперименты по заражению с потоком мочи несовместимы с текущим подходом к количественной оценке колонизации с использованием флуоресцентной микроскопии, поскольку моча демонстрирует сильную автофлуоресценцию. Искусственная моча (AU), используемая в данном исследовании, демонстрирует лишь очень ограниченную аутофлуоресценцию и, в отличие от образцов мочи, не различается по содержанию и концентрации.Хотя AU сконфигурирован так, чтобы точно имитировать химический состав мочи (Brooks and Keevil, 1997) и имеет тот же эффект, что и реальная моча на подавление экспрессии T1F, в более ранних исследованиях мы обнаружили, что AU не оказывает такого же эффекта на рост UPEC, когда речь идет об индукции изменений морфологии бактерий (Klein et al., 2015), которые могут влиять на колонизацию поверхности.

Чтобы продемонстрировать применение методологии, мы исследовали влияние T1F на способность UPEC колонизировать слои уроэпителиальных клеток.Важность T1F в адгезии / инвазии уроэпителиальных клеток хорошо описана в исследованиях статических клеточных культур (Martinez et al., 2000; Zhou et al., 2001; Martinez and Hultgren, 2002; Eto et al., 2007). ) и исследования на мышах (Connell et al., 1996; Bahrani-Mougeot et al., 2002). В текущем исследовании мы проверили влияние T1F на весь прогресс от начальной адгезии до образования биопленки на уроэпителиальной поверхности в течение 24-часового периода времени под потоком AU. Этот эксперимент подтвердил более ранние исследования, показавшие значительное влияние T1F как на адгезию, так и на колонизацию UPEC на уроэпителиальной поверхности.

Роль T1F во время ИМП у людей была связана с некоторыми обсуждениями, поскольку T1F экспрессируется в ограниченной степени in vivo (Lim et al., 1998; Hagan et al., 2010) и, вероятно, только среди поверхностно-ассоциированных субпопуляции (Stærk et al., 2016). Эксперименты, проведенные в более раннем исследовании, чтобы проверить, влияет ли отсутствие T1F на UPEC в планктонном состоянии в посеве мочи на способность UPEC образовывать биопленку на материале катетера, не показали значительной разницы в полученных 8-часовых биопленках (Stærk et al. ., 2016). Однако при колонизации уроэпителия UPEC связывается с уроэпителиальными клетками посредством специфической адгезии рецептор-лиганд посредством связывания адгезина T1F FimH, специфически с уроплакинами на поверхностных уроэпителиальных клетках (Wu et al., 1996). Таким образом, можно ожидать, что отсутствие T1F в UPEC, растущем в моче, значительно замедлит способность бактерий связывать и колонизировать уроэпителий. В нашем анализе это было подтверждено, показывая задержку на 6–10 часов в поверхностной колонизации в основном T1F-отрицательными UTI89 дикого типа, которые были предварительно культивированы в AU.Эта задержка хорошо соответствует ранее описанной задержке транскрипционной активации оперона fim , которая была впервые обнаружена через 8-12 часов после начальной адгезии (Stærk et al., 2016). Активация оперона может быть результатом механизма поверхностного зондирования, который передает внутриклеточный сигнал, способствуя переключению промотора переключателя fim в положение ON. Альтернативно, это может быть результатом избирательной адгезии нескольких T1F-положительных UTI89, которые закладывают основу для последующей T1F-положительной поверхностной популяции.Дополнительные эксперименты, например, со штаммом fim GFP-репортер, изученным в представленной установке, должны позволить дальнейшее выяснение этого механизма.

В заключение, представленная методология делает возможным подробный анализ способности колонизации бактериального эпителия и открывает возможности для непрерывного исследования взаимодействий исходных клеток-хозяев и патогенов. Следующим шагом в эволюции моделей для воспроизведения взаимодействий между эпителием и бактериями является контроль роста дифференцированных слоев эпителиальных клеток, т.е.g., позволяя отшелушивать клетки и выращивать 3D-культуры, а также моделировать слизистые слои, которые в некоторых нишах, таких как кишечник, являются первым веществом, с которым сталкиваются кишечные патогены. В сочетании с добавлением иммунных клеток и факторов гуморального иммунного ответа можно будет моделировать реакции на инфекцию и воспаление с еще большей точностью. Помимо предоставления более подробных сведений о взаимодействиях хозяина и патогена, это позволит ученым лучше связать экспериментальные модели in vitro с моделями инфекции животных.

Авторские взносы

Идея и дизайн исследования были разработаны RP, RG и TEA. Экспериментальные работы выполнены RP, TBA и CA. Написание рукописи было выполнено RP, RG, KS, HK, JM-J и TEA. Все авторы были вовлечены в обсуждение и интерпретацию результатов на всех этапах подготовки рукописи.

Финансирование

Это исследование было поддержано грантом докторантуры университетской больницы Оденсе номер 901, грантом доктора философии региона Южной Дании номер 13/7117 и грантом фонда Лундбек номер R164-2013-16181.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Тину Кронборг за техническую помощь в создании штаммов GFP E. coli . Мы также благодарим доктора О. Крута, доктора Т. Симидзу и доктора Д. Дж. Клумппа за предоставление штаммов бактерий для этого исследования.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2018.00016/full#supplementary-material

Список литературы

Альберт, М. Дж., Грант, Т., и Робинс-Браун, Р. (2000). «Изучение бактериальной адгезии к культивируемым клеткам», в Справочник по бактериальной адгезии , ред. Я. Х. Ан и Р. Дж. Фридман (Тотова, Нью-Джерси: Humana Press), 541–552.

Google Scholar

Альшариф, Г., Ахмад, С., Ислам, М. С., Шах, Р., Басби, С. Дж., И Крахлер, А. М. (2015). Присоединение хозяина и сдвиг жидкости интегрированы в механический сигнал, регулирующий вирулентность в Escherichia coli O157: H7. Proc. Natl. Акад. Sci. США 112, 5503–5508. DOI: 10.1073 / pnas.1422986112

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Андерсен, Т. Э., Хандиге, С., Маделунг, М., Брюер, Дж., Колмос, Х. Дж., И Мёллер-Йенсен, Дж. (2012). Escherichia coli уропатогенез in vitro : инвазия, ускользание от клеток и вторичная инфекция проанализированы на модели инфицирования клеток мочевого пузыря человека. Заражение. Иммун. 80, 1858–1867. DOI: 10.1128 / IAI.06075-11

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Азередо, Дж., Азеведо, Н. Ф., Бриандет, Р., Черка, Н., Коенье, Т., Коста, А. Р. и др. (2017). Критический обзор методов биопленки. Крит. Rev. Microbiol. 43, 313–351. DOI: 10.1080 / 1040841X.2016.1208146

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Bahrani-Mougeot, F. K., Buckles, E. L., Lockatell, C. V., Hebel, J. R., Johnson, D. E., Tang, C. M., et al. (2002).Фимбрии типа 1 и внеклеточные полисахариды являются главными уропатогенными детерминантами вирулентности Escherichia coli в мочевых путях мышей. Мол. Microbiol. 45, 1079–1093. DOI: 10.1046 / j.1365-2958.2002.03078.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст

Берри, Р. Э., Клумпп, Д. Дж., И Шеффер, А. Дж. (2009). Уротелиальные культуры способствуют формированию внутриклеточного бактериального сообщества с помощью уропатогенной Escherichia coli . Заражение.Иммун. 77, 2762–2772. d

Гистопатология глазной поверхности

Меланоцитарные поражения конъюнктивы имеют широкий спектр нарушений. Они варьируются от доброкачественных до очень злокачественных смертельных опухолей. В следующих подразделах будут обсуждаться наиболее распространенные дифференциальные диагнозы меланоцитарных поражений конъюнктивы.

3.2.1. Невус конъюнктивы

Невус конъюнктивы — наиболее распространенные меланоцитарные опухоли конъюнктивы. Конъюнктивальные невусы обычно начинают появляться у детей или подростков в виде группы пигментированных клеток в базальном слое конъюнктивального эпителия.Невусы конъюнктивы чаще встречаются у кавказцев (89%), реже страдают африканцы (6%) и азиаты (5%) [33]. Конъюнктивальные невусы обычно пигментированы, но примерно 16% могут быть амеланотическими или частично пигментированными [12, 34]. Юкста-лимбальная локализация — наиболее частая локализация у более чем двух третей пациентов. Другие локализации включают мясистую часть, полулунную складку, свод, предплюсну и роговицу [34, 35].

Существует три типа невусов конъюнктивы в зависимости от их гистологического расположения: составные, субэпителиальные и узловые невусы встречаются реже.Сложные невусы характеризуются наличием меланоцитарных клеток в эпителиально-субэпителиальном соединении и в строме (рис. 6). Субэпителиальные поражения располагаются исключительно в субэпителиальной области. Они часто связаны с включениями эпителия кистами и бокаловидными клетками (рис. 7). Соединительные невусы состоят из гнезд клеток невуса на эпителиально-субэпителиальном соединении. Они редки, за исключением детей. Эти типы считаются скорее фазами миграции клеток невуса из базального эпителия в строму конъюнктивы.

Рисунок 6.

Гистопатологический вид сложного невуса конъюнктивы с гнездами клеток невуса у основания эпителия конъюнктивы и внутри собственной субстанции (исходное увеличение × 50, гематоксилин и эозин).

Рисунок 7.

Гистопатологический вид субэпителиального невуса конъюнктивы с кистозными областями, выстланными конъюнктивальным эпителием и бокаловидными клетками в собственном веществе (первоначальное увеличение × 100 периодической кислоты-Шиффа).

Злокачественная трансформация оценивается как <1% [21, 35]. Однако новое начало в среднем возрасте или более позднем возрасте, необычное расположение (например, свод, предплюсна, карункул, складка), большие поражения более 10 мм в диаметре, выступающий питающий сосуд или внутренняя васкуляризация с кровотечением, некистозные поражения и неподвижные очаги поражения (т. е. прикрепленные к подлежащей эписклере) являются клиническими показаниями для удаления очага [36].

3.2.2. Меланоз, связанный с цветом лица (CAM)

CAM, также известный как расовый меланоз, представляет собой доброкачественное двустороннее поражение конъюнктивы, обнаруживаемое у лиц с темной пигментацией [8, 12].Обычно это наблюдается в перилимбальной области и редко в своде или конъюнктиве век. При осмотре наблюдаются некистозные плоские образования различной пигментации.

3.2.3. Первичный приобретенный меланоз (PAM)

PAM определяется как пролиферация меланоцитов в эпителии конъюнктивы. Это чаще встречается у людей со светлой кожей и обычно одностороннее. Обычно это коварно начинается в среднем возрасте. Воздействие солнечного света может быть фактором риска развития ПАМ.Это может происходить из-за аномалии нервного гребня, как это также наблюдалось у пациентов с нейрофиброматозом [37].

Он представляет собой плоскую коричневую, поверхностную, некистозную, одиночную, пятнистую, диффузную или многоочаговую пигментацию, охватывающую бульбарную, сводную и конъюнктиву глазного яблока или роговицу. Изредка можно увидеть амеланотический ПАМ [8, 21, 38]. Клеточная атипия, определяемая биопсией и тщательным гистопатологическим исследованием, с помощью иммуногистохимического окрашивания (с использованием окраски мелан-А для выделения меланоцитов), является основным фактором риска прогрессирования меланомы (рисунки 8 и 9).В одном исследовании 311 глаз с PAM поражения без атипии или с легкой атипией продемонстрировали 0% прогрессирование в меланому. С другой стороны, 13% пациентов с ПАМ с тяжелой атипией прогрессировали в меланому [21].

Рисунок 8.

Гистопатологическое проявление первичного приобретенного меланоза конъюнктивы (PAM) с пролиферацией меланоцитов в основании эпителия конъюнктивы без признаков атипии (исходное увеличение × 200 гематоксилин и эозин).

Рисунок 9.

Иммуногистохимическое окрашивание другого случая первичного приобретенного меланоза конъюнктивы (PAM), четко показывающего пролиферацию меланоцитов в основании эпителия конъюнктивы без признаков атипии (исходное увеличение × 200 Мелан-A).

Клинические показания для выполнения биопсии включают диаметр поражения ≥5 мм, прогрессирование, утолщение, появление узелка, васкуляризацию, поражение конъюнктивы глазного яблока или роговицы, пациентов с личным или семейным анамнезом синдрома диспластического невуса и анамнезом глазного или экстраокулярная меланома [12].

3.2.4. Меланома конъюнктивы

Меланома конъюнктивы, хотя и встречается редко, представляет собой второе по частоте злокачественное поражение конъюнктивы после плоскоклеточного рака [39]. В прошлом его развитие почти всегда приводило к неблагоприятному прогнозу, что приводило к экзентерации орбиты в попытке искоренить высокоинвазивное заболевание. Он представляет собой проблему для клинициста и патолога, потому что он может присутствовать на нескольких изображениях и возникает из явно доброкачественных поражений, таких как невусы конъюнктивы [40].Меланома конъюнктивы чаще всего поражает белых людей с частотой от 0,24 до 0,80 на 1 000 000 населения [41, 42]. Это чаще встречается у пожилых людей со средним возрастом от 55 до 70 лет [41, 42, 43, 44, 45, 46, 47]. Хотя это и редко встречается у молодых людей, имеются сообщения о случаях меланомы конъюнктивы у пациентов в возрасте до 20 лет [48, 49]. Существенной разницы между мужчинами и женщинами нет [41, 42, 43, 44, 45, 46, 47].

Меланома конъюнктивы возникает из-за ПАМ в 75% случаев, предшествующего невуса в 20% и de novo в 5% [8, 12].К системным факторам риска относятся синдром диспластического невуса, нейрофиброматоз и пигментная ксеродермия [38]. Воздействие солнечного света также считается причиной развития бульбарной меланомы конъюнктивы. Наиболее частым локализацией меланомы конъюнктивы является бульбарная конъюнктива в перилимбальной области, но она может возникать в любом месте, например, на конъюнктиве глазного яблока или конъюнктивы, складках или в области карункула [45, 47, 50, 51].

Клинически меланома конъюнктивы может иметь различные формы.Классически это проявляется в виде образования или повышенного пигментного поражения конъюнктивы. В некоторых случаях он может казаться более диффузным или множественным, с плохо определенными границами, особенно когда он связан с PAM [22]. Реже меланома конъюнктивы может проявляться в виде розового или красноватого пигментного поражения или даже быть амеланотической, что затрудняет распознавание и, таким образом, задерживает диагностику и лечение [47]. Более того, рецидив меланомы конъюнктивы после иссечения обычно является амеланотическим [12].Повторяющийся и постоянный контакт конъюнктивы с меланомой края соседнего века может вызвать вторичную меланому конъюнктивы (имплантационная меланома) [52]. Как и SCC, меланома конъюнктивы классифицируется в соответствии с классификацией AJCC-TNM. Меланомы конъюнктивы могут метастазировать регионально в преурикулярные и подчелюстные лимфатические узлы. Отдаленные метастазы поражают мозг, печень, кожу и кости [53].

Меланоцитарная интраэпителиальная неоплазия конъюнктивы (C-MIN) — это термин, используемый для описания поражений, демонстрирующих пролиферацию меланоцитов.Оценка C-MIN основана на нескольких факторах, включая характер горизонтального и вертикального эпителиального поражения, степень клеточной атипии, ядерный и клеточный диаметр, а также наличие ядрышек и митотических фигур. Затем C-MIN оценивается от 0 до 10, где 0 соответствует отсутствию какой-либо пролиферации меланоцитов или атипии (т.е. только меланоз), 1–4 соответствуют тяжести PAM (то есть легкой, средней и тяжелой атипии). и 5–10, соответствующие меланоме конъюнктивы in situ (рис. 10) [54].

Рис. 10.

Гистопатологический вид меланомы конъюнктивы in situ с атипичной пролиферацией меланоцитов, охватывающей всю толщину эпителия конъюнктивы (исходное увеличение × 200 периодической кислоты-Шиффа).

Поражения обычно демонстрируют атипичную пролиферацию меланоцитов, характеризующуюся обильной цитоплазмой, выступающими ядрышками и атипичными митотическими фигурами с инвазией в нижележащую строму конъюнктивы, а также прилегающий эпителий.Атипичная пролиферация меланоцитов может быть ограничена эпителием на ранних стадиях в случаях, возникающих в результате PAM (меланомы in situ) с радиальным распространением, аналогично кожным меланомам. Поражение должно быть удалено целиком, не касаясь его, иссекая его вдоль лимба, чтобы предотвратить посев опухолевых клеток в хирургической области.

Патологическое исследование иссеченного поражения должно включать наблюдение таких важных характеристик, как изъязвление, толщина опухоли и преобладающий гистологический тип клеток (т.е., эпителиоид или веретено) и фаза вертикального роста. Другие важные характеристики включают лимфоцитарную инфильтрацию, сосудистую или периневральную инвазию и митотическую активность, определяемую с помощью индекса Ki-67. Кроме того, следует также наблюдать микроскопический сателлитоз, определяемый как отдельные опухолевые гнезда, отделенные от основной злокачественной массы [55].

Очевидные гистопатологические особенности, которые связаны с худшей выживаемостью, включают толщину опухоли более 2 мм, наличие язв, эпителиоидную морфологию, более высокое количество митотических фигур (> 1 / мм ² ), лимфоваскулярную инвазию и микросателлитоз [55, 56].Экстрабульбарная меланома конъюнктивы, как обнаружено в исследовании с многофакторным анализом, связана с плохим исходом [57].

Иммуногистохимические (ИГХ) окрашивания меланоцитов, таких как мелан-А красный, MART-1, белок S-100, HMB-45 и маркер пролиферации клеток Ki-67, могут помочь в выявлении проблемных случаев меланоцитов. В меланоме конъюнктивы иммуногистохимическая экспрессия HMB-45 и Ki-67 выше, чем то, что наблюдается в PAM или невусах конъюнктивы [58]. Бета-катенин — это маркер ИГХ, который более сильно экспрессируется в меланомах конъюнктивы по сравнению с невусами и PAM.Таким образом, его роль в меланоме конъюнктивы отличается от меланомы кожи, при которой потеря экспрессии бета-катенина связана с более агрессивным течением [58]. Белок запрограммированной гибели клеток 1 (PD-1) и его взаимодействие с его лигандом PD-L1, исследованные у пациентов с меланомой конъюнктивы, показали повышенный риск отдаленных метастазов и худшую выживаемость при экспрессии опухолью [59].

BRAF — это человеческий ген, кодирующий белок B-Raf, протоонкоген. Меланома конъюнктивы является одним из злокачественных новообразований, связанных с мутацией BRAF.Более высокая вероятность отдаленных метастазов может наблюдаться в меланомах конъюнктивы, экспрессирующих мутации BRAF. Меланома конъюнктивы и меланома кожи демонстрируют сходство по значимости этого типа мутации и ее значимости для клинической картины [57, 60].