Пласты кубического эпителия с пролиферацией: Пролиферация клеток молочной железы | Рак

alexxlab Разное

Содержание

Мазок на ЦИТОЛОГИЮ — расшифровка цитограммы (NILM, ASCUS, LSIL, HSIL)?

МАЗОК НА ЦИТОЛОГИЮ — МЕТОД МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕРВИКАЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ С ЦЕЛЬЮ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА ШЕЙКИ МАТКИ.

Содержание:

Мазок на цитологию в первую очередь проводится для обнаружения атипичных клеток, что позволяет на ранних этапах диагностировать дисплазию (CIN, LSIL, HSIL) или рак шейки матки. Это недорогой и удобный метод для профилактического охвата большого количества женщин. Конечно, чувствительность однократного исследования невысокая, однако ежегодный массовый скрининг в развитых странах позволил значительно снизить смертность женщин от рака шейки матки.

В связи с тем, что атипичные клетки могут располагаться на относительно небольшом участке слизистой, очень важно, чтобы материал был получен со всей поверхности шейки матки, особенно из цервикального канала! Для этого созданы специальные щеточки, позволяющие получать материал из недоступных для осмотра областей.

Особое внимание придается зоне трансформации, клетки которой чаще всего подвергаются опухолевому перерождению. Именно в зоне трансформации развивается до 80-90% рака шейки матки, остальные 10-20% приходятся на цервикальный канал.

Когда сдавать мазок на цитологию? Взятие мазка на цитологию следует проводить начиная с 5-го дня менструального цикла и за 5 дней до предполагаемого начала менструаций. Нельзя проводить анализ в течение двух суток после полового сношения либо введения во влагалище свечей. Несоблюдение этих правил может привести к ошибочной трактовке результатов. Так же наличие выраженного воспалительного процесса в шейке матки и влагалище серьезно осложняют диагностику.

Следует отметить, что забор материала — это достаточно неприятная процедура. Гинеколог должен соскоблить эпителий с поверхности шейки и зайти в цервикальный канал. Чем больше попадет эпителия из различных зон — тем качественнее диагностика. Иногда после цитологии могут оставаться кровоподтеки, это считается нормальным.

Таким образом, основное значение мазка на цитологию — это определение качественных изменений клеток. Для определения инфекционного агента, вызвавшего воспаление, лучше использовать мазок на флору или бактериологический посев. Однако при цитологическом исследовании врач может отметить присутствие каких либо микроогранизмов. К нормальной микрофлоре относятся палочки (лактобациллы), единичные кокки, в небольшом количестве может быть условно-патогенная флора. Наличие специфических инфекционных агентов (трихомонады, амебы, грибы, гонококки, гарднереллы, лептотрикс, хламидии, обилие кокков) считается патологией, которую необходимо лечить.

Обработка мазков. Сроки выполнения цитологии

После забора материала, образец переносится на предметное стекло, фиксируется и окрашивается. При прямом переносе мазка со щеточки возможна частичная потеря материала и деформация клеток, что ведет к снижению чувствительности метода и большому числу ложных результатов. На смену классическому методу пришла жидкостная цитология, что значительно повысило точность и качество исследования.

Жидкостная цитология — это новая технология обработки мазков, которая заключается в помещении проб в контейнер со специальным стабилизирующим раствором. При этом в раствор попадает весь полученный эпителий, который затем центрифугируется и очищается от нежелательных примесей (слизи и др). На сегодняшний момент жидкостная цитология становится «золотым стандартом» для исследования мазков со слизистой шейки матки. Но и в этом случае чувствительность однократного исследования не превышает 60-70%. В репродуктивном возрасте часты ложноотрицательные результаты, а у женщин в менопаузе — ложноположительные. Только трехкратное цитологическое исследование позволяет приблизиться к 100%.

Существуют различные методы окраски препаратов: по Papanicolau (Пап-тест), по Романовскому, по Wright-Diemsa, по Граму. Все методы направлены на окрашивание определенных клеточных структур, что позволяет дифференцировать различные типы эпителия, отличать клетки с ороговением и опухолевой трансформацией. Тест Папаниколау широко признан и сейчас используется как основной стандартизированный метод.

Сколько времени делается тест? В зависимости от организации процесса результат можно получить в течение 2-3 дней.

Цитограмма без особенностей — что это значит?

Варианты цитологического заключения широко варьируют. Как вариант нормы, могут употребляться следующие заключения: «цитограмма без особенностей«, «цитограмма в пределах нормы«, «цитограмма без интраэпителиальных поражений«, «цитограмма соответствует возрасту — атрофический тип мазка«, «NILM — Negative for intraepithelial lesion or malignancy«, «пролиферативный тип мазка«. Все это — НОРМА!

Слизистая шейки матки в норме гладкая, блестящая, влажная. Плоский эпителий бледно-розовый, железистый эпителий — ярко красный. Клеточный состав, который можно встретить в нормальной цитологии представлен в таблице.

Цитограмма без особенностей (NILM) у женщин репродуктивного возраста
ЭкзоцервиксХорошо сохранившиеся клетки плоского эпителия, преимущественно поверхностного, промежуточного слоев.
ЭндоцервиксКлетки железистого (цилиндрического) эпителия.
Зона трансформацииКлетки плоского эпителия, единичные клетки или мелкие скопления метаплазированного плоского эпителия, небольшие скопления железистого эпителия.
Атрофический тип мазка — что это значит?

У женщин в переменопаузе и менопаузе за счет снижения общего уровня эстрогенов замедляются многие метаболические процессы, что приводит в результате к атрофии плоского эпителия. Эти изменения можно увидеть в цитограмме. Атрофический тип мазка относится к варианту нормальной цитограммы. Часто можно встретить в заключении фразу «цитограмма соответствует возрасту» или «возрастные изменения nilm«. Все это — варианты нормы!

Нужно понимать, что у женщин в менопаузе очень часты ложноположительные результаты цитограммы — тот случай, когда цитологу сложно отличить атрофичный плоский эпителий от дисплазии. Это нужно понимать, поскольку при последующей биопсии шейки матки патологии обычно не находят. Кроме того у пожилых женщин может быть склонность к кератинизации эпителия с формированием гиперкератоза (лейкоплакии).

Цитограмма без особенностей (NILM) у женщин в пере- и менопаузе (атрофический тип мазка)
ЭкзоцервиксХорошо сохранившиеся клетки плоского эпителия, преимущественно парабазального и базального слоев. Чаще бывают мазки атрофического типа, но могут быть и пролиферативного или смешанного типов.
ЭндоцервиксОтсутствие клеток цилиндрического (железистого) эпителия не является показателем плохого качества мазка, поскольку в этот период зона трансформации смещается глубоко в канал и для получения железистого эпителия щеточку нужно вводить на глубину более 2-2,5 см.
Зона трансформацииКлетки плоского, метаплазированного эпителия.

Слизистая шейки матки в менопаузе истончена, легко травмируется и подкравливает, что является следствием снижения эстрогенов.

Расшифровка цитограммы

Терминология

Мазок на цитологию- норма

Дискариоз и дискариоциты — аномальные клетки с гиперхромными (плотными и темными) ядрами и нерегулярным ядерным хроматином. За дискариозом последует развитие злокачественного новообразования. Используется как синоним дисплазии, но как более общий термин.

Атипия — любое отличие структуры клетки от нормы. Смысл зачастую зависит от контекста. Но чаще все же используется для описания предопухолевых и опухолевых изменений.

Воспалительная атипия — сочетание дегенеративных, реактивных, пролиферативных изменений клеток при воспалении. Эти изменения могут стать причиной ложно-положительного диагноза дисплазии или рака.

Дисплазия — процесс нарушения созревания плоского эпителия. Является истинным предопухолевым процессом. Имеет 3 степени. К первой обычно относят вирусное поражение, ко второй и третьей — поражение с опухолевым потенциалом.

Дисплазия эпителия тяжелой степени

ASCUS — атипичные клетки, которые трудно дифференцировать с реактивной атипией и собственно предопухолевым процессом. Атипия неясного значения.

Дискератоз — нарушение кератинизации отдельных клеток плоского эпителия. Является признаком ВПЧ.

Паракератоз — нарушение кератинизации эпителиального пласта. Поверхностные клетки плоского эпителия всегда имеют некоторую степень кератинизации — это защитный механизм. Паракератоз может наблюдаться в норме, при раздражении слизистой любой причины, или при ВПЧ-поражении.

Койлоцитоз (койлоцитарная атипия, койлоцит) — специфические изменения ядер, характерные для вируса папилломы человека.

Койлоциты, многоядерная клетка

Гиперкератоз (лейкоплакия) — выраженная кератинизация эпителиального пласта с появлением защитного бесструктурного слоя из кератогиалина. Это нормальный процесс для кожи, но в слизистых оболочках считается патологией. Наблюдается при ВПЧ-инфекции, а также при раздражении слизистой, особенно при опущении органов малого таза, выпадении матки.

Плоскоклеточная метаплазия — защитный механизм, физиологический процесс замещения нежного железистого эпителия более устойчивым плоским эпителием. Метаплазированный эпителий часто становится источником дисплазии и рака, так как легко поражается вирусом папилломы человека.

Железистая гиперплазия — пролиферация, активный рост железистого эпителия. Является реактивным процессом при воспалении, эрозии шейки матки. Часто встречается при использовании гормональных препаратов.

Классификация Bethesda (США) — расшифровка цитограммы
Оценка качества мазка
Материал полноценныйСодержит клетки плоского  и цилиндрического эпителия в достаточном количестве.
Неудовлетворительный для оценки (неинформативный) материалСкудное количество клеток или их отсутствие.
Цитограмма в пределах нормы (NILM)Содержит клетки поверхностного и промежуточного слоев многослойного плоского эпителия, клетки метаплазированного эпителия, лейкоциты, клетки цилиндрического эпителия, клетки эпителия эндометрия.
Метаплазия (норма)Клетки плоского метаплазированного эпителия свидетельствуют о том, что материал забран из зоны трансформации.
Реактивные изменения
Цитограмма воспаленияДегенеративные и реактивные изменения клеток, воспалительная атипия, плоскоклеточная метаплазия, гиперкератоз, паракератоз, койлоцитоз и другие признаки вирусного поражения.
АтрофияКлетки базального и парабазального типов -мелкие клетки с гиперхромным ядром и скудной цитоплазмой. Часто могут ошибочно трактоваться как клетки с атипией, давая ложноположительный результат цитологии.
Патологические изменения эпителия
ASCUS (atypical squmous cells of undetermined significance)Изменения, которые трудно дифференцировать между реактивными изменениями эпителия и дисплазией. При ASCUS определяются клетки, трактовка которых затруднена — клетки с дискариозом, укрупненными и гиперхромными ядрами. Рекомендуется динамическое наблюдение и дообследование, а именно повторное цитологическое исследование через 6 месяцев и ВПЧ-тестирование. В случае подтверждении ASCUS и наличии вируса папилломы человека высокого онкогенного риска — проводится кольпоскопия. Исследования показывают, что 20% женщин с ASC имеют дисплазию после более тщательного обследования.
Предопухолевые изменения
LSIL (CIN I)Слабовыраженное интраэпителиальное поражение, включающее папилломавирусную инфекцию. Рекомендуется наблюдение без активной терапии. У большинства женщин LSIL самостоятельно регрессирует в течение нескольких лет. В эту группу объеденены все изменения с низким злокачественным потенциалом, поскольку цитолог зачастую не может отличить изменения при ВПЧ инфекции и собственно CIN 1.
HSIL (CIN I-II)Умеренно выраженное и тяжелое интраэпителиальное поражение. Рекомендуется удаление всех пораженных тканей методом (конизация) с последующим морфологическим исследованием. В эту группу объеденены все изменения с высоким злокачественным потенциалом.
AGC (atypical glandular cells)Атипические клетки цилиндрического эпителия. Рекомендуется выскабливание цервикального канала для гистологического исследования.
Опухолевые изменения
Плоскоклеточный ракЗлокачественная опухоль из плоского эпителия.
Железистый ракЗлокачественная опухоль из железистого эпителия эндоцервикального типа.
Эндометриальный ракЗлокачественная опухоль, развивающаяся из слизистой оболочки матки и прорастающая в цервикальный канал.

Классификация цитологических изменений по Папаниколау несколько проще, чем Bethesda. Однако, посыл остается тем же. Имеется раздел доброкачественных реактивных изменений, которые не угрожают здоровью, класс предопухолевой патологии и собственно рак шейки матки. Каждый класс выделен на основании прогноза, риска злокачественной трансформации и необходимого медицинского вмешательства.

Классификация цитологических изменений по Папаниколау
I класснорма
II классдоброкачественная атипия (реактивные изменения)
III классдисплазия (предопухолевые изменения)
IV классcancer in situ
V классинвазивный плоскоклеточный рак

Читайте также:

  1. Дисплазия шейки матки — тактика лечения

пролиферация эпителия — 25 рекомендаций на Babyblog.ru

Девочки, привет! Помогите разобраться пожалуйста кто сталкивался…

Все у меня было хорошо, пошла к гинекологу из за того что на Джесе месячные стали скудные слишком. Она взяла стандартные анализы, мазок и цитологию. Пришла за результатами, и они оказались плохие как врач сказала. Надо говорит биопсию делать. Но детально ничего не объяснила( Только напугала и расстроила…

Исследование соскоба с шейки матки цервикального канала

Микроскопическое описание:

Эндоцервикс и Эктоцервикс-скопление клеток цилиндрического эпителия с признаками пролиферации, явления плоскоклеточной метаплазии эпителия, скопление клеток плоского эпителия поверхностного и промежуточного слоев с реактивными изменениями, часть клеток с явлением дискариоза и паракератоза.

Заключение: Возможно, эктопия шейки матки. Рекомендуется исключить HPV.

Уроuенитальные мазки:

Эпителиальные клетки

влагалище: умерено

шейка матки: единичные в поле зрения

эритроциты: не обнаружено

лейкоциты:

влагалище: 20-30

шейка матки: 40-50

флора

влагалище: палочки обильно

шейка матки: палочки умерено

грибы не обнаружено

простейшие (трихоионады) не обнаружено

neisseria gonorroeae не обнаружено

Девченки, кто понимает подскажите по анализам, все настолько плохо?((( Не понимаю я типичнее клетки есть или нет, обычно четко было написано всегда что нет атипичных клеток!

а результат этого анализа я вообще не понимаю…Дисплазия что ли? Колпоскопию кстати не делали мне и даже не предлагали, сразу сказала что надо биопсию. ВПЧ есть у меня давно, но проявлений не было никогда. До родов появилась эрозия очень маленькая, в этот раз врач тоже сказала что она есть но очень очень маленькая. Пока назначила просто свечи противовоспалительные. К слову, врачу и клинике я не доверю…просто пошла по ДМС от работы к ним. Они мне в прошлый раз уже ставили внематочную беременность, хотя по сроком просто плодное яйцо еще не опустилось…после этого я очень сомневаюсь в их компетентности. Думаю куда со всем этим теперь идти, может сразу в онко центр? в Герцена…или может в Кулаково?

Расшифровка результатов биопсии эндометрия — ProBiopsii.ru

В среднем расшифровка результатов биопсии эндометрия занимает 1-2 недели. Это зависит от режима работы патоморфологической лаборатории и сложности применяемых окрасок.

Значимую роль играет и метод взятия биоптата слизистой оболочки матки – в одних случаях врач-морфолог получает цельные фрагменты тканей с сохранной гистологической структурой, тогда как в других велика вероятность получить всего лишь сгустки крови.

Содержание статьи

Методики проведения биопсии


Чаще всего биопсию эндометрия берут путем традиционного диагностического выскабливания (РДВ). Получаемый материал представляет собой отдельные участки слизистой оболочки, в которых отчетливо видны маточные железы, соединительнотканная строма и их взаимоотношения друг с другом. Если в образце присутствуют злокачественные элементы, патоморфолог может с высокой точностью определить глубину их прорастания, а это напрямую влияет на тактику лечения и прогноз заболевания.

В отличие от РДВ при аспирации эндометрия и пайпель биопсии врач получает не целостные пласты слизистой, а ее разрозненные элементы с большой примесью крови. Нередко биоматериал представлен ничем иным, как скудным скоплением отдельных клеток, по которым нельзя достоверно судить о характере патологического процесса.

С точки зрения диагностической ценности результатов биопсии эндометрия предпочтение следует отдать раздельному диагностическому выскабливанию. Тем не менее, в ряде случаев всеобъемлющая расшифровка биоптатов не требуется. Так, пайпель биопсия обычно проводится для оценки состояния эндометрия перед процедурой ЭКО. В этой ситуации даже разрозненных элементов слизистой оказывается достаточно, чтобы определить тип патологии.

Расшифровка результатов биопсии эндометрия


В своем заключении врач-патоморфолог может дать различную расшифровку биопсии эндометрия, с подробным описанием морфологии или без нее. Часто к результатам прилагается патоморфологический диагноз, который представляет собой краткое резюме описательной характеристики.

Ниже дана расшифровка различных терминов, которые можно встретить в результатах биопсии эндометрия.

  • Аденокарцинома – синоним рака матки.
  • Аденомиоз – разрастание маточных желез в миометрии (мышечной оболочке матки). Редкая находка, преимущественно при РДВ.
  • Атрофическая слизистая – истонченный эндометрий с единичными железами. Вполне нормальное явление для менопаузы; в более молодом возрасте указывает на серьезные гормональные нарушения.
  • Ворсины хориона – вспомогательные компоненты плодного яйца, благодаря которым оно прикрепляется к слизистой матке. Впоследствии они трансформируются в плаценту. Наличие ворсин хориона в соскобе эндометрия – однозначный признак беременности.
  • Гиалиноз – уплотнение и сужение просвета мелких маточных артерий.
  • Гиперплазия атипическая – разрастание эндометриальных желез с признаками злокачественной трансформации. Потенциально предраковое состояние.
  • Гиперплазия простая
     – то же самое, но без признаков опухоли. Встречается при гормональных нарушениях на фоне кисты яичника и других состояний.
  • Гипопластическая слизистая – истонченный эндометрий, занимающий промежуточное состояние между зрелым и атрофическим.
  • Гравидарная слизистая – эндометрий беременной матки с полями децидуальной ткани.
  • Детрит – обозначение аморфных масс, представленных остатками погибших клеток.
  • Децидуальная ткань – скопления крупных клеток, содержащих обилие питательных веществ. Признак беременности.
  • Дисплазия – изменение структуры и клеточного состава маточных желез, напоминающее опухолевую трансформацию.
  • Киста – расширенная железа, заполненная жидкостью.
  • Лейомиома – доброкачественная опухоль из гладких мышц, расположенных в средней оболочке матки.
  • Лимфоидные фолликулы – скопления лимфоцитов, отражающие длительный воспалительный процесс (например, хронический эндометрит).
  • Менструальная слизистая – эндометрий в разгар месячных.
  • Метаплазия – состояние, при котором нормальный эпителий слизистой матки замещается на эпителий, характерный для другого органа.
  • Плацентарный полип
     – остатки плаценты после выкидыша, аборта или естественных родов (реже после кесарева сечения).
  • Полип – любое образование слизистой, выступающее в просвет матки.
  • Пузырный занос – патология беременности, вариант трофобластической болезни. Характеризуется разрастанием одних лишь ворсин хориона; плод при этом не формируется.
  • Реакция Ариас-Стеллы – вариант изменения эндометрия, напоминающие трансформацию желез канала шейки матки во время беременности. Указывает на гиперпластический процесс.
  • Регенерирующая слизистая – эндометрий в первые 1-3 сут после менструаций.
  • Спиральные артерии
     – мелкие кровеносные сосуды, пронизывающие слизистую оболочку матки. Основной источник ее кровоснабжения.
  • Строма – ткань, в которую погружены эндометриальные железы.
  • Трофобласт – клеточный материал, из которого образуются ворсины хориона и другие вспомогательные структуры эмбриона.
  • Фаза пролиферации – соответствует 5-14 дню менструального цикла (после после месячных).
  • Фаза секреции – соответствует 15-26 дню менструального цикла (до месячных).
  • Фиброз – разрастание плотной соединительной ткани в строме. Признак хронического воспаления, а также нормальное явление в постменопаузе.
  • Хориокарцинома
     – злокачественная опухоль из атипичных ворсин хориона, вариант трофобластической болезни. Если говорить грубо, то хориокарцинома – это «раковый пузырный занос».
  • Эндометрит – воспаление слизистой оболочки матки.

Последующие действия


Дальнейшая тактика зависит от метода, которым брали биоптат. Если по результатам аспирационной или пайпель биопсии выявлена гиперплазия и признаки атипии, то это в большинстве случаев служит показанием для раздельного диагностического выскабливания.

Если помимо указания фазы цикла и наличия крови или детрита в заключении больше ничего не указано, то фактически это указывает на отсутствие какой-либо патологии со стороны эндометрия.

Последующие действия пациентки и гинеколога должны быть направлены на исключение других причин дисфункционального маточного кровотечения.

Наличие опухолевых изменений, в том числе атипической гиперплазии, требует регулярного динамического наблюдения и консультации онкогинеколога. Устанавливается стадия онкопроцесса и назначается комплексное лечение, включающее операцию, химиотерапию и лучевую терапию.

Лечение в Израиле


Израильские гинекологи обладают значительным опытом в лечении различных заболеваний матки. Применяя современные технологии, врачи клиники Топ Ихилов точно определяют вероятность злокачественного перерождения новообразований и проводят их эксцизию малоинвазивными методами.

Чтобы узнать более подробную информацию касающиеся вашего случая заполните форму ниже.

Для безоперационного лечения в Топ Ихилов используют новейшие препараты, эффективность которых превышает 90%, и передовые методики: брахитерапию, фотодинамическую терапию, радиотерапию с применением установок TrueBeam последнего поколения и многие другие.

Если не остается выбора и необходимо провести хирургическое удаление опухоли или даже матки, в Топ Ихилов часто применяют роботизированную хирургическую установку Да Винчи. Такая операция полностью исключает возможность врачебной ошибки и предотвращает осложнения.

Узловая мастопатия с пролиферацией эпителия: профилактика и лечение

Количество женщин, которым ставят диагноз дисплазия молочной железы, становится все больше. Среди патологий груди самой распространенной является мастопатия. Различают диффузную и узловую мастопатию. Последняя, в свою очередь, делится на несколько видов, среди которых самой опасной считается узловая мастопатия с атипичной пролиферацией эпителия. Риск возникновения онкологического заболевания возрастает, когда между дольками и протоками появляется много больших кист. Ранняя диагностика значительно повышает шансы на выздоровление, поэтому очень важно регулярно посещать маммолога.

Почему возникает патология

Фиброзно-кистозная мастопатия представляет собой патологию, при которой происходит нарушение нормального состояния эпителия и соединительной ткани. В ходе развития заболевания формируются кисты и фибромы.

Опасной считают мастопатию с ярко выраженной пролиферацией.

Пролиферация – это размножение или распространение клеток.

Если уровень пролиферации не высокий, то мастопатия в рак превращается очень редко. При умеренной пролиферации эпителия риск увеличивается. Треть пациенток с резкой пролиферацией впоследствии будет лечить рак молочной железы.

Доказано, что мастопатия в половине случаев является предшественником рака.

Главное, причиной мастопатии является нарушение гормонального фона. Молочная железа очень уязвима перед воздействием гормонов. Любые отклонения в их работе сказываются на ее состоянии. Нарушаться гормональный фон может по многим причинам. Это наследственность, неправильный образ жизни, стрессы, сопутствующие заболевания, некоторые лекарственные препараты и многое другое.

Из всех гормонов больше всего на молочную железу влияет эстрадиол, который является одни из видов эстрогенов и прогестерон.

Первый отвечает за:

  • Размножение и созревание клеток эпителия.
  • Формирует дольки молочных желез.
  • Стимулирует кровообращение, развивает сеть сосудов.
  • Повышает количество жидкости в соединительной ткани.

Прогестерон действует так:

  • Замедляет деление клеток эпителия.
  • Делает сосуды менее проницаемыми, что предупреждает отек соединительной ткани.

Если уровень прогестерона ниже, чем должен быть, то соединительная ткань отекает и увеличивается, а высокий уровень эстрогена приводит к активному делению клеток эпителия, из-за чего и образуются кисты. Высокий уровень пролактина приводит к нагрубанию молочных желез.

Особенности и признаки узловой мастопатии

Одной из форм фиброзно-кистозной мастопатии является узловая мастопатия. Для нее характерно образование в молочной железе узлов и кист. Эта форма заболевания поражает женщин после 30 лет и наиболее опасна, так как при сильной пролиферации перерастает в рак.

Заболевание может поражать одну или сразу обе молочные железы.

Определить патологию можно по таким симптомам:

  1. Самостоятельно в молочных железах можно нащупать уплотнение с четкими границами. Его можно передвигать с места на место, так как оно не соединено с кожей или соском.
  2. За несколько дней до месячных грудь становится плотной и начинает болеть. Ощущения проходят с наступлением менструаций.
  3. Узлы отекают, из-за чего молочные железы увеличиваются в размере.
  4. Неприятные ощущения могут охватывать руку, плечо, подмышечную область.
  5. Узлы ощущаются, только если женщина стоит, в лежачем положении их обнаружить нельзя.
  6. Близлежащие лимфоузлы не увеличиваются.
  7. При надавливании на сосок из него выделяется прозрачная, желтая или коричневая жидкость.

Узловая мастопатия возникает по причинам гормональных нарушений. Лечение заболевания проводят комплексное.

Как ставят диагноз

При возникновении первых симптомов необходимо обратиться к гинекологу или маммологу. Только специалист может точно поставить диагноз и назначить соответствующее лечение.

Чтобы точно определить патологию, необходимо провести комплексное обследование, которое включает такие мероприятия:

  • Осмотр и пальпация молочных желез. Этот метод дает больше информации сразу после окончания месячных. Вторая фаза цикла не даст полной информации, так как в груди начинаются физиологические изменения. На приеме у врача необходимо сообщить ему о наличии каких-либо заболеваний, рассказать о своих симптомах. Дальше пациентка должна раздеться до пояса. Чтобы врач оценил состояние кожи груди, ее симметричность, молочные железы ощупывают в положении стоя и лежа. Также оценивают состояние лимфоузлов. Если были обнаружены какие-то изменения, назначают дополнительные обследования.

  • УЗИ, маммография и МРТ. Ультразвуковое исследование проводят если женщине нет 40 лет. Это безопасный способ, при котором не используют ионизирующее излучение, оно более информативно, так как лучше обнаруживает кисты, даже самые маленькие, а также подробно описывает их структуру. Для женщин за 40 этот метод не подходит, так как происходит жировое перерождение ткани и новообразования становится трудно обнаружить. В этом случае понадобится маммография. Эту процедуру проводят с помощью рентгеновских лучей. Оно позволяет обнаружить даже те новообразования, которые меньше сантиметра. Но беременным и кормящим женщинам этот метод противопоказан. Его не нужно проводить и молодым женщинам, так как у них молочные железы более плотные и точной информации получить нельзя. МРТ является наиболее информативным из всех методов, но процедура достаточно дорогостоящая.
  • Пункция или биопсия. Это необходимо при подозрении на рак. С помощью тонкой иглы берут образец ткани и отправляют на гистологическое исследование. Если обнаруживают признаки злокачественного процесса, лечение проводят хирургическое.

Лечение заболевания

Какой метод лечения выберут, зависит от формы патологии. Если мастопатия узловая, то за женщиной наблюдает онколог. При пролиферации эпителия сразу назначают оперативное вмешательство.

Выполняют секторальную резекцию, то есть разрез проводят в виде сектора, начиная от центра груди. После удавления новообразования его отправляют на гистологию. Если анализ подтверждает наличие злокачественных клеток, лечение продолжают в виде удаления всей молочной железы. Но даже после удаления груди проводят медикаментозное лечение для устранения причин заболевания.

Если в молочной желез киста, то ее прокалывают и удаляют содержимое, которое также отправляют на гистологическое исследование. После этого оценивают внутреннюю поверхность кисты путем введения в нее воздуха. Если стенки кисты гладкие, то лечение продолжают консервативное, а через полгода проводят повторное обследование.

Если по истечении этого времени киста закрылась, женщина продолжает употреблять лекарства. При повторном наполнении жидкостью ее вырезают и отправляют на анализ.

Если при осмотре видно, что киста имеет неровную поверхность, то сразу проводят операцию, и уже потом назначают необходимые препараты.

Консервативное лечение назначают с целью избавиться от причин, вызвавших заболевание.

В первую очередь лечат заболевания печени и репродуктивной системы, а также нормализуют работу щитовидки. Для улучшения состояния печени используют гепатопротекторы. Они восстанавливают ее клетки, улучшают жировой обмен.

После этого назначают такие препараты:

  • Успокоительные. В лечении фиброзно-кистозной мастопатии большую роль играет психологическое состояние женщины. Стрессы и нервозность могут только усугубить ситуацию. Поэтому необходимы средства для укрепления нервной системы. Обычно это растительные препараты валериана или пустырник.

  • Витамины необходимы для нормализации гормонального фона и укрепления состояния всего организма. В качестве антагониста эстрогенов используют витамин А, он также уменьшает пролиферацию клеток. Витамин Е усиливает действие прогестерона. В6 уменьшает количество пролактина. Р и С улучшают кровообращение и уменьшают болезненные проявления заболевания. Такие средства принимают курсами по несколько месяцев, после чего делают перерыв и продолжают лечение. Такая терапия может растянуться на годы.
  • Йодсодержащие препараты показаны женщинам, у которых нет проблем со щитовидной железой. Небольшие дозы йода стимулируют синтез половых гормонов в организм женщины.
  • При отеках, до начала менструации рекомендуют принимать мочегонные препараты. Обычно используют травяные средства или чаи. Также на период лечения рекомендуют употреблять как можно меньше соленой пищи.

Так как мастопатия развивается под влиянием гормонального сбоя, то лечение часто включает гормональные препараты:

  1. Антиэстрогены. Они уменьшают биологическую активность эстрогенов. Лечебный эффект можно заметить через несколько месяцев употребления средства. Положительный результат можно заметить через месяц-два после начала лечения. В первые недели болезненные проявления мастопатии могут даже усилиться.
  2. Оральные контрацептивы. Такие препараты используют для подавления овуляции. Они позволяют снизить симптомы мастопатии уже в первые месяцы использования, но, чтоб достичь полного выздоровления, длительность терапии должна составлять не менее года.
  3. Гестагены. Эти препараты помогают подавить функцию эстрогенов и гормоны меньше влияют на грудь. Гестагены эффективно снимают болезненные проявления мастопатии и отлично помогают справиться с разрастанием новообразований.
  4. Средства для подавления секреции пролактина.

Такие препараты ни в коем случае нельзя употреблять без ведома врача, иначе можно только усугубить ситуацию.

Некоторым противопоказан системный прием гормонов. В этом случае могут назначать местные препараты. Это различные гели, мази, имплантаты.

В дополнение к препаратам можно использовать рецепты народн

Умеренная пролиферация эпителия желудка что это такое

Стенка желудка состоит из 4 слоев: внутренней слизистой оболочки, подслизистой основы, мышечного слоя и наружной серозной оболочки. Слизистая оболочка (СО) в норме складчатая, в ней имеются углубления – ямки, плоские участки (поля) и складочки.

Эпителий слизистой – высокопризматические (столбчатые) клетки, которые выстилают весь желудок и все его складки в один слой. Клетки этого эпителия секретируют особую слизь, она образует слой до 1-1,5 мм толщиной. При производстве ферментов и соляной кислоты в этом слое образуются временные каналы. Слизь защищает стенку от переваривания соком желудка и различных повреждений. Обновление эпителия происходит каждые 1-3 суток.

Что такое пролиферация

Клеточная пролиферация – это нормальный процесс, необходимый организму для обновления. Иначе говоря, это физиологическое размножение клеток с итогом в виде увеличения объема ткани. Управляется этот процесс гормонами. Пролиферация происходит в любом органе и ткани. Она контролирует состояние иммунитета, приводит к уничтожению дефектов тканей, регенерирует их и восстанавливает прежнее функционирование органов. За счет пролиферации растет соединительная ткань, формируются новые сосуды, рубцуются ожоги, устраняются повреждения с заменой тканей на новые клетки или соединительную ткань. Это касается клеток крови, эпителия и слизистых, хрящей, стенок миокарда и пр. Наиболее активный процесс происходит в слизистой желудка.

Но пролиферация при определенных условиях может становиться патологической, т. е. избыточной. Например, при повышенной концентрации соматропина она приводит к увеличению органов и конечностей. Если в процессе пролиферации нарушается дифференцировка клеток, это становится началом онкологии с появлением атипичных разрастаний. Такое бесконтрольное активное (аномальное) деление клеток называется гиперпролиферацией или гиперплазией. Это можно также объяснить преобладанием пролиферации над дифференциацией клеток слизистой. Тогда число узко дифференцированных клеток уменьшается и эпителий начинает терять свои “законные свойства” за счет незрелых клеток. Пролиферация покровного эпителия может и часто сопровождается процессами кишечной метаплазии желудка.

Гиперплазия

Пролиферация покровно-ямочного эпителия желудка является одним из подвидов пролиферации слизистой. Название дано потому, что в результате разрастания ткани происходит образование ямок штопорообразной формы. Данная пролиферация означает гиперплазию клеток, вырабатывающих слизь (бокаловидные клетки), которая играет защитную роль. Покровный эпителий подвергается мутации, в клетках повышается содержание муцина, выталкивающего ядра к основанию клетки, патологические клетки начинают замещать здоровые. Формируются ямки в слизистой, которые по форме напоминают штифт штопора. Процесс является предвестником онкологии.

Чаще всего пролиферация покровно-ямочного эпителия возникает при гиперпластическом гастрите, язвенной болезни, язвенноподобном раке. По клинике и морфологии они идентичны, поэтому требуется биопсия. Цитологическое исследование может выявить выраженную пролиферацию покровно-ямочного эпителия желудка. По сути, это предраковое состояние, и такие больные должны находиться на учете у онколога и проходить систематическое обследование.

Причины развития

Главная причина – хроническое или длительное повреждение и раздражение слизистой, что вызывает появление ран и язв. Помимо вышеназванных патологий, причиной может быть:

  • наследственная предрасположенность;
  • нарушения гормонального фона;
  • присутствие Хеликобактер пилори – продукты ее жизнедеятельности загрязняют весь организм, что угнетает иммунитет, разрушает слизистую и вызывает пролиферацию покровно-ямочного эпителия; указанная бактерия приводит к воспалению слизистой желудка и развитию гастритов в 90% случаев;
  • нарушения питания, в котором много добавок Е, консервантов, спиртного;
  • прием НПВС;
  • стрессы;
  • изменения в работе 12-перстной кишки (она провоцирует избыток гастрина, раздражающего слизистую желудка; забрасывание желчи при рефлюксе) и поджелудочной железы.

Классификация

Выделено несколько типов желудочной гиперплазии. Они различаются по виду и поражаемым участкам. К основным относятся следующие:

  • антральная;
  • очаговая;
  • фовеолярная;
  • железистая;
  • полиповидная;
  • лимфофоликулярная;
  • пролиферация покровного-ямочного эпителия желудка;
  • лимфоидная.

Коротко о видах

Существуют следующие виды патологии:

  1. Фовеолярная гиперплазия желудка. При этом складки и желудочные ямки деформированы, они удлинены и искривлены. Самый частый и неопасный тип. Развивается при приеме НПВС.
  2. Антральная – ткани разрастаются в месте перехода слизистой желудка в ДПК. Причиной становится недостаточное питание. Выглядит эти изменения как множественные мелкие наросты.
  3. Лимфофолликулярная – слизистая утолщается и разрастается за счет скопления лимфоцитов, образующих фолликулы. Возможна малигнизация. При лимфоидной гиперплазии поражается чаще антральная часть желудка, когда в лимфоузлах повышается количество лимфоцитов. С увеличением лимфоцитов слизистая утолщается и гиперплазируется. Причем увеличение лимфоузлов в данном случае не носит воспалительного характера. Причины – язвенная болезнь и инфекционные поражения пищеварения.
  4. Железистая – самая редкая форма, при ней идет пролиферация железистых клеток и образование круглых и овальных полипов. Возникает при растягивании желудка.
  5. Полиповидная – появление множественных полипов в любом отделе желудка. Причина неизвестна.
  6. Очаговая – «бородавочная» – появление дополнительной ткани в одном или нескольких местах. Процесс наблюдается в начальных стадиях гиперплазии и является доброкачественным.

То есть можно сказать, что пролиферация клеток покровно-ямочного эпителия это пролиферативный рост клеток, вырабатывающих слизь.

Степени пролиферации

Сегодня гиперплазию разделяют на 3 этапа:

  1. Первая степень – уменьшается выработка слизи, отмечается гиперхроматоз. Процесс начальный, он обратим при должном лечении.
  2. Вторая степень – умеренная пролиферация покровно-ямочного эпителия. Процесс уже более явный, ускоряется и учащается деление клеток, число клеток Панета и бокаловидных уменьшается. Процесс еще можно остановить своевременным и современным лечением.
  3. Третья степень – выраженная пролиферация клеток покровно-ямочного эпителия желудка. Пролиферируют большие участки, слизь не выделяется, защиты нет, процесс становится предраковым.

Симптомы и признаки

Долгое время человек не догадывается о существовании у себя патологии, у него нет никакого недомогания, поэтому так запаздывает ранняя диагностика. Затем, по мере прогрессирования процесса, сначала после еды появляется сильная боль в верхней части живота, тошнота, потеря аппетита, кислая отрыжка, икота.

В запущенных стадиях наблюдается рвота, общая слабость, вздутие живота, метеоризм. Боли могут носить схваткообразный характер – сначала они колющие или в виде жжения, затем становятся ноющими. Стул нарушается, склонен к диарее. Появляются признаки интоксикации – бледность, головная боль, головокружения, температура, чувство напряженных мышц. Симптомы неспецифичны, поэтому часто остаются без внимания. Ранняя диагностика имеет первостепенное значение: необходимо своевременно выявить и назначить эффективное лечение пролиферации покровно-ямочного эпителия желудка. Он опасен, но на первых стадиях податлив терапии.

Диагностические мероприятия

Главным методом диагностики является гастроскопия. При таком обследовании возможно проведение биопсии с последующей гистологией. Досконально осматривается слизистая желудка и все изменения в ней специалист может увидеть сразу.

При обследовании врач может увидеть новообразования, аномалию тканей и оболочек.

Рентгенография с барием позволит выявить полипы, их форму и размеры ножек. При установлении этиологии проводится анализ на наличие Хеликобактер пилори. Это и тест на дыхание с применением мочевины, и анализ крови на антитела.

Если поставлен диагноз “выраженная пролиферация покровно-ямочного эпителия hp” с некоторым количеством крестиков, то это говорит о присутствии в слизистой Хеликобактер пилори. Немалую роль может сыграть биопсия, ее проводят при гастроскопии. Исследование дает возможность установить факт наличия болезни и ее подвид. Надо сказать, что сочетание пролиферации покровно-ямочного эпителия и хеликобактера – не такое уж редкое явление.

Принципы лечения

Терапия заболевания многокомпонентная, имеет цель улучшить моторику желудка и нормализовать выработку соляной кислоты.

Лечение пролиферации покровно-ямочного эпителия, т. е. гиперпластического гастрита, зависит от этиологии, подвида пролиферации, гипо- или гиперацидности, тяжести клиники и сопутствующих заболеваний. Самостоятельное назначение препаратов категорически запрещено.

Как лечить пролиферацию покровно-ямочного эпителия желудка? Для терапии назначают группы следующих препаратов:

  1. Спазмолитики – “Но-шпа”, “Папаверин”, “Спазган”, “Дротаверин”. Снимают спазм и боли.
  2. Антибиотики – “Амоксициллин”, “Тетрациклин”, “Кларитромицин” и др.
  3. Противомикробное средство “Метронидазол” и препараты висмута. Используются для эрадикации (выведения) бактерии хеликобактер в случае ее наличия.
  4. Ферментные препараты – “Фестал”, “Креон”, “Мезим”, “Панзинорм” и др. Применяются для улучшения пищеварения.
  5. Антациды – “Ренни”, “Алмагель”, “Маалокс” и др. Убирают изжогу, боли, защищают слизистую.
  6. Аминокислоты – “Метионин”, “ВСАА” и др. Необходимы для восполнения дефицита белка.
  7. Поливитамины – витамины группы В, вит. С и Р.
  8. При гипоацидных состояниях назначают препараты желудочного сока – “Пепсин”, соляная кислота.
  9. Для снижения повышенной секреции – ингибиторы протонной помпы. Их назначают редко, эффективны они в начальных стадиях. В последние годы при консервативной терапии используют гипербарическую оксигенацию.

Народные методы лечения

Что касается народных способов лечения, то они могут помочь на начальных стадиях. Фитотерапия используется только по согласованию с лечащим врачом, носит симптоматический характер. Применяют отвары трав с противовоспалительным эффектом.

Очень полезной считается ромашка – чай из нее имеет спазмолитическое и противовоспалительное действие. Антибактериальными свойствами обладает имбирь. Чай с мятой, настой петрушки или иван-чая снимут тошноту и изжогу.

Когда нужна операция

Оперативное лечение гипертрофического гастрита проводят при неэффективности консервативной терапии. Показания к операции следующие:

  • желудочные кровотечения;
  • полипы желудка;
  • наличие или подозрение на малигнизацию процесса;
  • тяжелое течение патологии.

Проводится эндоскопическое удаление полипов (полипэктомия), резекция желудка (полная или частичная). Полипы образуются при всех видах гиперплазий, могут быть и наследственными. Последние чаще злокачественные

Эндоскопически удаляют полипы больше 1 см. Маленькие образования не удаляют, если нет подозрения на злокачественность, но их развитие отслеживают – раз в полгода обследуют.

Специальная диета

Питание должно быть сбалансированным. Следует принимать пищу небольшими порциями (дробно), желательно в одно время, каждые 3 часа.

Желательно полностью отказаться от алкоголя и любых, раздражающих слизистую, продуктов: солений, копченостей, маринадов, консерваций, квашеных блюд, фастфудов, газировки и полуфабрикатов. Соль надо минимизировать, под запрет попадают консервы и красное мясо. Вся еда должна быть только отварной, все жареное под запретом.

Рекомендован стол № 2. Эта система питания назначается при болезнях кишечника и гастритах. Ее предназначение – остановить развитие воспаления и нормализовать работу секреторного аппарата желудка.

Прогноз зависти от подтипа гиперплазии и ее интенсивности, своевременности и современности диагностики.

Профилактические мероприятия

Специфической профилактики гиперплазии желудка не существует, но общие рекомендации по оздоровлению никто не отменял. Питание должно быть с достаточным содержанием витаминов и минералов, следует отказаться от курения и спиртного, избегать негативных эмоций и стрессов. Старайтесь выбирать продукты с наименьшим количеством консервантов и канцерогенов. Заведите привычку перед каждым приемом пищи выпивать стакан воды, чтобы за сутки в организм поступало не меньше 2 л чистой воды. Не злоупотребляйте противовоспалительными препаратами, даже если они вам помогают. Активный образ жизни тоже поможет избавиться от множества болезней. Не забывайте каждые полгода посещать гастроэнтеролога. Если вам очень не нравится метод ЭФГДС, можете просто пройти УЗД.

Пролиферация покровно-ямочного эпителия является опасной патологией, которая в запущенных случаях провоцирует онкологические заболевания. Важна ранняя диагностика, чтобы купировать очаги поражения на начальных стадиях.

Пролиферация железистого эпителия — что это такое? Характеристика болезни :: SYL.ru

Пролиферация железистого эпителия матки – диагноз, с которым может столкнуться любая современная женщина. К сожалению, пока нет действительно абсолютно работающих способов, методов, позволяющих предупредить такую аномалию состояния репродуктивной системы. Патология обычно выявляется на приеме гинеколога, а образцы тканей отправляют на цитограмму. Пролиферация железистого эпителия может быть показанием для срочного начала терапевтической программы, но иногда состояние просто фиксируют в анамнезе, не предпринимая никаких мер. От чего это зависит и что принято понимать под сложным названием, попробуем рассмотреть подробнее.

Общая информация: что это такое

Пролиферация железистого эпителия – термин, которым принято обозначать увеличение концентрации железистых элементов. Подобные трансформации довольно часто отмечаются в слизистых маточной шейки. В настоящее время заболевание само по себе к патологиям не причисляется, но в некоторых случаях может указывать на нарушения здоровья. Для уточнения ситуации требуются дополнительные исследования, сбор анамнеза.

Анатомическая база

Чтобы понять, что это такое (пролиферация железистого эпителия), необходимо представлять устройство женской репродуктивной системы. Слизистая органов, доступная гинекологу во время обычного осмотра, полость влагалища изнутри выстланы многослойным плоским эпителием. Этот материал защищает нежные внутренние ткани, способен регенерировать. А вот цервикальный канал, контактирующий с описанными элементами системы, покрыт эпителием другого типа: высокими цилиндрическими клетками. Эта ткань однородная, канал отличается обилием желез, соединенных в сложную, разветвленную сеть. Именно тут генерируются слизистые выделения.

Эпителий в шейке матки меняется, что связано с особенностями менструального цикла, гормональными процессами в организме. Регулярные исследования позволяют составить полную картину индивидуальных особенностей конкретной женщины. В период овуляции цервикальные железы продуцируют больший объем слизи, консистенция корректируется. Более подробные исследования позволяют понять, что маточная шейка – довольно неоднородный по своей структуре орган, где два типа эпителия постепенно переходят один в другой. На основании такого факта доктора говорят о неоднозначности набора функций. Если при исследованиях обнаружен железистый эпителий с признаками пролиферации, это говорит о большем, нежели норма, числе железистых образований. Возможно нарушение, изменение функциональности этих участков, формы.

Некоторые особенности

Иногда наблюдается пролиферация железистого эпителия шейки матки, причем нарушения строго ограничены цервикальным каналом, иногда изменения охватывают ткани наружной стороны маточной шейки. Такие характерны пострадавшим от инфекций, воспалительных процессов областям. У некоторых женщин выраженная пролиферация железистого эпителия обусловлена травмами. Привести к подобному результату могут местные гормональные сбои.

Клиническая картина определяется многими факторами. Иногда изменения не сопровождаются симптомами и выявляются только в ходе профилактического регулярного осмотра, в других ситуациях пролиферация клеток железистого эпителия сопутствует инфекционным процессам ярко выраженной формы. Нередко заболевание сочетается с псевдоэрозией. Для такого состояния характерно наличие видоизмененных тканей влагалищных маточных элементов.

Особенности диагностирования

При подозрении на пролиферацию клеток железистого эпителия необходимо посетить участкового гинеколога. Выслушав жалобы пациентки, врач проводит визуальный осмотр репродуктивной системы. Возможно обнаружение участков тканей, отличающихся от расположенных рядом цветом. Это становится основанием для проведения дальнейших исследовательских мероприятий с целью уточнения диагноза. Цитология, кольпоскопия – наиболее результативные подходы, помогающие исследовать клеточный состав нестандартного элемента, понять, что это такое. Пролиферация железистого эпителия выявляется при лабораторном исследовании цитологического мазка.

Благодаря специализированным исследованиям врач уточняет, насколько повышена концентрация желез относительно нормального строения, а также изучает структуру изменений. На основании полученных сведений можно делать вывод, идет ли речь о злокачественных преобразованиях тканей. Впрочем, как видно из медицинской статистики, умеренная пролиферация железистого эпителия обычно не свидетельствует ни о каких серьёзных нарушениях в работе женского организма.

Что делать?

На приеме доктор объяснит, если у пациентки выявлена пролиферация железистого эпителия, что это такое и чем грозит в конкретном случае. Изолированного лечения такого нарушения здоровья не проводят. Сначала необходимо определить, по какой причине развилось отклонение, и устранить именно его. В некоторых случаях состояние эпителия приходит в норму самостоятельно, иногда требуются дополнительные мероприятия.

Откуда пришла беда?

По какой причине развивается пролиферация железистого эпителия шейки матки? Этот вопрос наверняка волнует любую женщину с соответствующим диагнозом. Врачам удалось выявить множество ситуаций, приводящих к таким последствиям. Не всегда дело в серьезной патологии, поэтому постановка диагноза – это еще не повод для паники. В частности, длительный прием оральных контрацептивов у совершенно здоровой женщины может спровоцировать появление отдельных участков пролиферации. Патологические причины чаще наблюдаются следующие:

  • инфекционные процессы;
  • воспалительное поражение тканей влагалища;
  • аналогичные изменения в цервикальном канале;
  • цервицит (по разнообразным причинам).

Будучи инфицированной, репродуктивная система женского организма активизирует защитные природные механизмы, затрагивающие в том числе структуру железистого эпителия шейки. Пролиферация является ответом на нежелательную микрофлору, удалить которую организм пытается посредством изобилия секрета. То есть нежелательные микроорганизмы словно бы вымываются с тканей. Благодаря такой мере защиты инфекция не может проникнуть вглубь. С другой стороны, реакция организма приводит к разрастанию железистой ткани, удлинению отдельных элементов, разветвлению структур.

Гормоны и клетки железистого эпителия с признаками пролиферации

Эпителий шейки матки развивается под влиянием циклических гормональных изменений в женском организме. При дисфункции гормональной системы заметны различные сбои, в том числе и в структуре, строении этой ткани. Нередко к подобному приводят патологии, нарушающие работу эндокринной системы. Во время беременности перестройка организма также провоцирует корректировку толщины этого слоя слизистой. При вынашивании плода половые гормоны в женском организме присутствуют в нестандартном соотношении, что и вызывает подобную реакцию. В большинстве случаев отмечается, что для шеечного эпителия в крови наблюдается слишком низкий уровень эстрогена, что и приводит к изменениям.

Известны травмы, провоцирующие пролиферацию (гиперплазию) железистого эпителия. Что это такое: повреждения, полученные во время родов, прерывания беременности, диагностических, лечебных манипуляций. Все ситуации сопряжены с нарушением целостности слизистой влагалища, матки, что требует активизации регенеративных процессов. Это может стать причиной слишком активного роста тканей. В ряде случаев гиперплазия обусловлена псевдоэрозией. Отличительная особенность такого состояния – наличие вкраплений цилиндрического эпителия в шеечном многослойном. Он словно бы спускается по поверхности органа из цервикальной полости. Одновременно изменение структуры тканей влияет на количество и объем железистых клеток.

Заключение доктора

Пролиферация – состояние, сопровождающее широкий спектр гинекологических заболеваний, а вот самостоятельной картины у такого нарушения вовсе нет. Доктор, оценивая общее состояние женщины, жалобы, с которыми она пришла на прием, выбирает оптимальный вариант исследований, назначает анализы и формулирует заключения. Для двух пациенток со сходными проявлениями выводы врачей могут быть категорически разными. В такой ситуации не нужно паниковать или указывать на некомпетентность специалиста: действительно, ситуация вполне возможна. С другой стороны, столь значительная неопределённость процесса приводит к тому, что понять его, не имея специфического образования, очень сложно.

Пролиферация предполагает разрастание числа и объема желез шейки матки, причем расположение бывает разным: диффузным, очагами. Во многом это указывает на причину процесса. Тяжесть ситуации оценивают, глядя на выраженность изменений тканей, наличие воспалительных процессов и уровень их активности.

Как заметить?

Пролиферация железистого эпителия не сопряжена с какими-либо характерными клиническими симптомами. Обычно женщина обращается к врачу на основании проблем, связанных с сопутствующими патологиями. В частности, если гиперплазия обусловлена воспалением, тогда беспокоят обильные бели, дискомфорт в области влагалища. При гормональных нарушениях наблюдаются сбои месячного цикла, кровотечения, в том числе в неположенное время, циклы без овуляции.

Нужно ли идти к врачу?

При подозрении на наличие патологий репродуктивной системы следует своевременно записаться на прием к гинекологу. Если врач диагностирует пролиферацию, назначают лабораторные исследования образцов тканей, чтобы выявить особенности клеточного состава. При этом визуальный осмотр обычно дает довольно скромный объем информации: специалист изучает внешнюю часть, наружный маточный зев, где и фиксирует отдельные участки, отличающиеся от окружающих тканей структурой и цветом. В норме эпителий светлого розового оттенка, что обусловлено его многослойностью, а ненормальные элементы более яркие, насыщенные.

У некоторых женщин наблюдаются не только отличающиеся расцветкой элементы, но и небольшие новообразования, диаметр которых не превышает один сантиметр. Это полусферические плотные объекты, которым характерны тонкие стенки. Внутреннее наполнение – желтоватого оттенка, просвечивающее. В медицине подобное именуют «наботовы кисты». Обычно патология наблюдается в цервикальной полости, в нижней трети объема, то есть там, где располагаются наботовы железы. Железы сами по себе – небольшие наполненные секретом трубочки. Содержимое поступает к внешним тканям через протоки вывода. Пролиферация приводит к перекрытию отверстий, закупорка провоцирует формирование наполненной секретом полости. Если такие кисты расположены глубоко в репродуктивной системе, визуально доктор увидеть их не сможет. Наличие формирований позволяет говорить о железисто-кистозной пролиферации.

Некоторые особенные случаи

Известны такие ситуации, когда гиперплазия локализовалась только в цервикальном канале. При визуальном осмотре у врача нет возможности выявить процесс, так как области недоступны для такого метода исследования.

Если патология сопровождается воспалениями, в качестве дополнительных симптомов наблюдаются:

  • локальное повышение температуры;
  • отечность слизистых;
  • обилие выделений.

Как показывает практика, в большинстве случаев пролиферация связана именно с инфекцией или воспалением, поэтому доктора всегда назначают лабораторные анализы – посев, мазок на флору, ПЦР. Это помогает выявить возбудителя, определить наличие специфических инфекций. При наблюдении менструальной дисфункции дополнительно берут анализы на выявление нарушений гормонального фона. Учитывают текущую фазу цикла.

Кропотливые исследования

Для детального изучения видоизменённых структур необходимы кольпоскопия, цитологический анализ. Учитывается, что пролиферация – неравномерный процесс, при котором слизистая обычно утолщается в некоторых местах, а железы отличаются друг от друга размерам, формой. Цитограмма даст точные сведения, лишь если процесс охватил маточную шейку (поверхность). В случае поражения цервикального канала таким образом, что за наружный зев гиперплазия не распространяется, точные данные можно получить лишь гистологическим исследованием. Для этого цервикальную полость осматривают, получают соскоб биологической ткани, направляемый на дальнейшие лабораторные исследования.

Как показывает медицинская статистика, зачастую пролиферация железистого эпителия наблюдается на фоне аналогичного процесса в эндометрии. Доктор, изучая состояние пациентки, осматривает всю слизистую внутри полости матки на предмет патологического состояния. Информативный анализ можно сделать, получив образцы тканей маточной полости, цервикальной. Их направляют на гистологическое исследование.

Это важно!

В большинстве случаев пролиферация железистого эпителия – доброкачественный процесс. Изредка исследование образцов ткани дает информацию об атипичных изменениях клеток. При такой трансформации необходимо провести ряд дополнительных исследований и, возможно, посетить онколога: гинеколог даст направления, объяснит особенность конкретной ситуации и все опасности, связанные с ней.

Необходимо помнить, что сама по себе пролиферация не требует срочного медицинского вмешательства, но вынуждает искать причину доброкачественных изменений. Есть вероятность, что источник проблем в серьезной патологии, устранение которой должно стать задачей первостепенной важности. Точные сведения дадут лабораторные исследования с применением современной техники. Если обнаружена инфекция, придется пройти курс лечения антибактериальными препаратами.

Эпителия: Руководство по гистологии

Эпителий: Клеточные соединения

Существует четыре основных типа межклеточных соединений:

Три разных типа соединительных узлов, которые связывают клетки вместе.

  1. окклюзионные переходы (окклюзионные зоны или плотные переходы)
  2. стыки (zonula adherens).
  3. десмосомы (слипшееся пятно).Есть также «гемидесмосомы », которые лежат на базальной мембране, чтобы помочь прикрепить клетки к подлежащей базальной пластинке.
  4. Щелевой переход с. Это коммуникативные узлы. (также известный как нексус, перегородка)

Эти типы клеточных соединений встречаются между эпителиальными клетками, но могут также встречаться между другими типами клеток.

Окклюзионные переходы

Границы двух ячеек сливаются вместе, часто по всему периметру каждой ячейки, образуя непрерывный пояс, подобный соединению, известному как плотное соединение или zonula occludens (zonula = латинское для пояса).Эти области клеток очень плотно связаны друг с другом, так что соседние плазматические мембраны герметично соединены друг с другом. Белки в мембране соседних клеток, называемые окклюдином, взаимодействуют друг с другом, создавая эту плотную изоляцию. В цитоплазме клетки окклюдин взаимодействует с актиновым цитоскелетом через другие белки, называемые ZO-1. Многие патогены действуют на белки, образующие этот плотный стык, делая его проницаемым.

Этот тип соединения значительно ограничивает прохождение воды, электролитов и других небольших молекул через эпителий.Трансмембранные белки из каждой клеточной мембраны сцепляются в межклеточном пространстве вокруг клетки в этом поясе (черные линии на диаграмме).

Проницаемость плотных стыков варьируется от участка к участку, и часто они могут быть выборочно негерметичными. Например, эти соединения важны в кишечнике, поскольку действуют как селективный диффузионный барьер, предотвращая диффузию водорастворимых молекул. Они также действуют, ограничивая локализацию мембраносвязанных белков. (Для получения дополнительной информации см. Раздел о кишечнике).

Прилипание стыков

Эпителиальные клетки удерживаются вместе прочными соединениями заякорения (zonula adherens).

Соединение спаек находится ниже плотного соединения (закрывающее соединение). В промежутке (примерно 15-20 нм) между двумя клетками находится белок кадгерин — гликопротеин клеточной мембраны. (Тип кадгерина, обнаруженного здесь, — E-кадгерин). Кадгерины из соседних клеток взаимодействуют, чтобы «застегивать» две клетки вместе.

Внутри клетки актиновые нити (микрофиламенты, показаны здесь красным) соединяют адгезионные соединения.Эти волокна имеют тенденцию располагаться по окружности вокруг клетки в виде «маргинальной» полосы.

Эта маргинальная полоса может сокращаться и деформировать форму удерживаемых таким образом клеток — это считается ключевым в морфогенезе эпителиальных клеток, например, в формировании протоков.

Десмосомы и гемидесмосомы

из Молекулярная биология клетки

Десмосомы соединяют две клетки вместе.Десмосома также известна как точечная десмосома или пятно сращивания (macula = латинское слово «пятно»), потому что она круглая или пятнистая по очертанию, а не в форме пояса или полосы, как слипчивые соединения.

Десмосомы особенно часто встречаются в эпителии, который должен выдерживать истирание (см. Кожу). Десмосомы также обнаруживаются в клетках сердца, но промежуточным филаментом в данном случае является десмин, а не кератин (который находится в эпителиальных клетках).

На рисунке изображена ЭМ десмосомы, образованной между двумя клетками.Обратите внимание на фазово-плотный материал между двумя клеточными мембранами, который состоит из трансмембранных линкерных гликопротеинов (например, демосглейнов и десмоколлинов, которые являются белками кадгерина). Также обратите внимание на промежуточные нити, идущие от десмосомы в цитоплазму.

Другие белки проходят через мембрану во внутриклеточное пространство, чтобы соединить две клетки вместе. Эти «трансмембранные линкерные» белки называются кадгеринами (обнаруженные здесь кадгерины называются десмоглеином и десмоколлином).

На диаграмме показана десмосома . Он состоит из плотной цитоплазматической бляшки, к которой прикрепляются промежуточные нити.

Гемидесмосомы

Они похожи на десмосомы, но отличаются функционально и по своему содержанию. Они соединяют базальную поверхность эпителиальных клеток через промежуточные филаменты с подлежащей базальной пластинкой. Трансмембранные белки гемидесмосом — это не кадгерины, а другой тип белка, называемый интегрином.

Щелевые соединения

Группа белковых молекул, называемых коннексинами, образует структуру, называемую коннексоном (каждая частица в B выше является коннексоном). Когда коннексоны (синие на диаграмме справа) из двух соседних ячеек (красная и желтая на диаграмме) выравниваются, они образуют непрерывный канал между ними.

Этот канал достаточно велик, чтобы позволить маленьким молекулам, таким как неорганические ионы, и другим небольшим водорастворимым молекулам (менее 1000 кДа) проходить между клетками.Однако канал слишком мал для прохождения белков, нуклеиновых кислот или сахаров.

Дисфункция эпителия дыхательных путей при муковисцидозе и ХОБЛ

Муковисцидоз — это генетическое заболевание, вызванное мутациями в гене CFTR, тогда как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) в основном вызывается факторами окружающей среды (в основном курением сигарет) на генетически предрасположенном фоне. Хотя этиология и патогенез этих заболеваний различны, оба они связаны с прогрессирующей обструкцией дыхательных путей, нейтрофильным воспалением дыхательных путей и рецидивирующими обострениями, предполагая общие механизмы.Эпителий дыхательных путей играет решающую роль в поддержании нормальных функций дыхательных путей. Основные молекулярные и морфологические изменения происходят в эпителии дыхательных путей как при МВ, так и при ХОБЛ, и все больше данных свидетельствует о том, что дисфункция эпителия дыхательных путей участвует в возникновении и прогрессировании обоих заболеваний. Структурные и функциональные аномалии как в дыхательных путях, так и в альвеолярном эпителии оказывают существенное влияние на изменение защитных сил организма, иммунный / воспалительный ответ и процесс восстановления, приводящий к прогрессирующему повреждению легких и нарушению функции легких.В этом обзоре мы рассматриваем доказательства критической роли дисфункциональных эпителиальных клеток дыхательных путей в хроническом воспалении и ремоделировании дыхательных путей при МВ и ХОБЛ, подчеркивая общие механизмы, участвующие в дисфункции эпителия, а также сходства и различия этих двух заболеваний.

1. Введение

Муковисцидоз (МВ) является наиболее распространенным генетическим заболеванием среди белых людей и возникает в результате мутаций в одном гене, кодирующем 1480 остатков трансмембранного гликопротеина, регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR).Заболевания легких, характеризующиеся хроническим нейтрофильным воспалением, прогрессирующей обструкцией дыхательных путей и бактериальными инфекциями дыхательных путей, являются основной причиной заболеваемости и смертности у пациентов с МВ [1, 2]. Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) — серьезная глобальная проблема здравоохранения, и, по оценкам, к 2020 году она станет третьей по значимости причиной смерти во всем мире; заболевание вызывается как генетическими, так и средовыми факторами; среди них курение сигарет является основным фактором риска ХОБЛ и вызывает воспалительную реакцию во всех дыхательных путях, альвеолах и легочной сосудистой сети [3, 4].Два преобладающих фенотипа при ХОБЛ — это эмфизема и хронический бронхит; однако у большинства пациентов они часто совпадают. Хотя МВ и ХОБЛ различаются во многих аспектах, они также имеют общие фенотипические и патологические особенности, предполагающие потенциальные механистические связи (Рисунок 1). Оба заболевания связаны с прогрессирующей обструкцией дыхательных путей, хроническим нейтрофильным воспалением в просвете дыхательных путей и повторяющимися инфекционными обострениями; обострения болезни вносят значительный вклад в заболеваемость и смертность при обоих заболеваниях и оказывают существенное влияние на качество жизни пациентов, а также на расходы на здравоохранение [1–4].


Эпителиальные клетки дыхательных путей (AEC) являются одними из первых мест контакта при ингаляционных инсультах и ​​играют решающую роль в поддержании нормальной функции дыхательных путей [5, 6]. Эпителий дыхательных путей представляет собой первичный участок соответствующих молекулярных и гистологических изменений как при МВ, так и при ХОБЛ, и в последние годы появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что он играет ключевую роль в возникновении и прогрессировании обоих заболеваний. Структурные и функциональные изменения как в дыхательных путях, так и в альвеолярном эпителии оказывают существенное влияние на изменение среды дыхательных путей, защитные механизмы хозяина и процессы восстановления, которые способствуют ограничению воздушного потока, характерному для обоих заболеваний.Таким образом, эпителий дыхательных путей может представлять собой подходящую мишень для новых терапевтических стратегий, направленных на восстановление целостности барьера и защиты от вдыхаемых частиц и патогенов. В этом обзоре мы рассматриваем доказательства критической роли дисфункционального эпителия дыхательных путей в нарушении местной защиты, измененных иммунных реакциях, хроническом воспалении дыхательных путей и ремоделировании при МВ и ХОБЛ, подчеркивая общие механизмы, участвующие в дисфункции эпителия, а также сходства и различия двух болезней.

2. Свойства эпителия дыхательных путей

Эпителий дыхательных путей действует как физический барьер, предотвращающий попадание потенциальных патогенов или вредных агентов на слизистую дыхательных путей и попадание в кровоток [7]. Кроме того, эпителий дыхательных путей контролирует транспорт ионов для поддержания гидратации дыхательных путей и, кроме того, действует как ключевой регулятор врожденных иммунных ответов на вторжение патогенов.

2.1. Барьерная функция

Пересечение одного или нескольких барьеров хозяина патогеном имеет решающее значение для инициации инфекции.Эпителий дыхательных путей обеспечивает физический барьер для микробной инвазии; он состоит из монослоя поляризованных эпителиальных клеток, которые поддерживают свою целостность за счет комплексов апикальных соединений (AJC). Они состоят из закупоривающих плотных соединений (TJ), закрепляющих адгезионных соединений (AJ), десмосом и GAP-соединений.

TJ регулируют движение ионов, макромолекул и иммунных клеток через межклеточное пространство; они имеют решающее значение для переноса ионов и действуют как барьер, регулирующий доступ воспалительных клеток и препятствуя проникновению вредных веществ, таких как микробные компоненты, в просвет дыхательных путей.TJ сконструированы из белков zona occludens (ZO), окклюдина, клаудинов и соединительных молекул адгезии (JAM). AJs обеспечивают межклеточную адгезию и сигнальные пути, которые контролируют рост, морфологию и дифференцировку клеток. Они расположены ниже TJ в t

Многослойный плоский ороговевший эпителий

Многослойный плоский ороговевший эпителий 40X
(Кожа ладони)

Хотя многослойный плоский ороговевший эпителий покрывает вся поверхность тела, большая часть также включает волосы, которые затрудняет просмотр основной структуры ткани.Если мы просто хотим чтобы посмотреть на многослойный плоский ороговевший эпителий, смотрим на коже одного из немногих участков тела, у которого нет волосы. Это ткань ладони (кожа ладони). Полоса показывает толщину многослойного плоского ороговевшего эпителий. На этом образце эпителий очень сильно окрашен. темно. Более светлые участки под ней — это соединительная ткань (КТ).

Многослойный плоский ороговевший эпителий 100X
(Кожа ладони)

На 100X вы можете видеть отдельные слои ячеек, которые делают это многослойный эпителий.Полоса указывает толщину многослойный плоский ороговевший эпителий (ССКЭ). Заметить, что ядра клеток нижних слоев имеют тенденцию к округлой форме. формы, но ядра кажутся более плоскими при движении к поверхности. Вы, наверное, заметили, что нижняя поверхность эпителия не плоская. Бугристый вид вызванные выступами соединительной ткани, называемыми дермальными сосочками. На всех изображениях на этой странице эпителий окрашен темнее, чем соединительная ткань.

Многослойный плоский ороговевший эпителий 400X
(Кожа ладони)

Клетки на поверхности многослойного плоского ороговевшего эпителия очень плоские. Они не только плоские, но и больше не живой. У них нет ядра или органелл. Они наполнены белок кератин, который делает нашу кожу водонепроницаемой. Стрелка вверху изображения указывает на ороговевший клетка, частично отделившаяся от остальной кожи.Эти мертвые клетки постоянно теряются с поверхности кожи и заменяются новыми клетками из нижележащих слоев. В ячейки в базальном (нижнем) слое на самом деле кубовидные или столбчатые в форме. Они делятся митозом, чтобы обеспечить постоянный запас. новых ячеек, которые заменяют те, которые потеряны с поверхности. Поскольку эти замещающие клетки постепенно выталкиваются на поверхность, их форма меняется. Они начинаются снизу в виде куба клетки, то они приобретают неправильную форму и, наконец, становятся очень плоские, так как они превращаются в мертвые, кератиновые поверхностные клетки.

ГИСТОЛОГИЯ ПОЛНЫЙ ТЕКСТ

Уильям А. Бересфорд, Массачусетс, доктор философии Фил ©
Профессор анатомии
Кафедра анатомии, Университет Западной Вирджинии, Моргантаун, США

Раздел 3l РЕГЕНЕРАЦИЯ

Регенерация — это повторный рост ткани или части органа после разрушение или потеря. Возможность восстановления структурно-функциональных целостность после травмы важна для выживания, и генетический отбор имеет оставили человеку большую часть регенеративной способности низших позвоночных.
В медицине многие из наблюдаемых травм осложняются такими факторами. как инфекция, химическое, тепловое и радиационное повреждение, обширное кровотечение, несвоевременное лечение, шок, множественные травмы, старость, недоедание и нарушение обмена веществ.
Тем не менее полезно знать, насколько хорошо отдельные ткани и органы может вылечиться после травмы при оптимальных условиях диеты, возраста, лечения и его время. У человека такие состояния могут преобладать при плановой хирургии.В обсуждение регенерации ниже относится к асептическим экспериментальным травмам в млекопитающие.
A ОБЩИЕ ПОНЯТИЯ
l Восстановление тканей и их организация для функционирования во многих отношениях воспроизвести первоначальное эмбриональное формирование ткани. Формация новой ткани требует развития новых клеток, как показано ниже.
ИСХОДНЫЕ КЛЕТКИ (а) Выжившие дифференцированные клетки (могут дедифференцироваться)
     | (б) Выжившие недифференцированные стволовые клетки
     | (c) Циркулирующие клетки в крови
     |
пролиферация 1 Стимулируется: пониженной плотностью упаковки клеток?
     | Физиологическая перегрузка? Факторы роста? Потеря роста
     | ингибиторы?
     | 2 Клеточные мембраны «чувствуют», что ткани отсутствуют, и
     | предложили мигрировать? и размножаться?
     |
     |
     V Специализация
НАСЕЛЕНИЕ КЛЕТОК -------------------------> ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ
                            вызванный
                                                      
                       1 Поддерживаемые нормативные программы
                       2 Непрерывность регенерирующей части со зрелой,
                          специализированная часть, эл.г., в скелетных мышцах
                          волокно
                       3 Индуцирующие вещества / факторы
                       4 Взаимодействие с внеклеточным матриксом
                       5 Ячеечные контакты и щелевые переходы
                       6 Механически и электрически
                          поляризованные поля

 
2 Новой ткани требуются новые клетки, полученные в результате пролиферации клеток
Степень, в которой происходит деление клеток, можно определить по радиоавтографическое исследование с использованием меченного тритием тимидина или на основе BrdU методы .Радиоавтография показала, например, что гладкие мышцы имеют более регенерирующая способность, чем та, которой не приписывали ранее Ткань с клетками, неспособными к делению, например нейронами, не может восстановить потерянные клетки, хотя отдельные нейроны могут восстановить некоторые повреждения своих процессы.

3 Организация дифференцирующихся клеток для восстановления органа
l Требуется координация регенераций более чем одной ткани, e.грамм., (а) железистые клетки, кровеносные сосуды и стромальные клетки, ECM и более поздние ретикулярные элементы, чтобы построить новые дольки в печени; (б) волокна скелетных мышц, соединительные ткани и нервные волокна для регенерации мышц и восстановления скелетно-мышечная функция. Ткани взаимодействуют индуктивно и трофически.
2 Регенерации тканей могут конкурировать , с функционально неблагоприятный исход, например,
.. (а) коллагеновая соединительная ткань может перерасти регенерирующий хрящ и кость при переломе скелета, и заполнить разрыв перелома фиброзным ткань недостаточно жесткая для поддержки;
.. (б) в поврежденном мозге глиальные клетки размножаются и активно подавляют рост аксонов.

4 Требования к регенерации
l Пространство : для роста ткани требуется пространство и само по себе ответ, подтверждающий наличие пространственного дефекта. Где ткань была поврежденные, фагоцитоз и лизис некротической ткани освобождают место для новых клетки. Когда дефект заполнен, пролиферация клеток снижается или остановился.Это торможение происходит даже тогда, когда «неправильная» ткань, например фиброзная CT восполняет пробел.
2 Связь между участвующими клетками посредством цитокинов и другие агенты.
3 Адекватный уровень гормонов, например, щитовидной железы.
4 Достаточное количество запасов или потребление аминокислот, витаминов и т. Д. Для синтез нового белка и других материалов.
5 Свобода от инфекции.
6 Неповрежденный кровоснабжение и дренаж для этой области.Иногда тоже продолжающаяся иннервация является необходимым координирующим и трофическим фактором.

5 Гиперплазия и гипертрофия
l Гиперплазия — это реакция ткани, включающая митоз и образование новых ячеек, увеличение количества ячеек для удовлетворения спроса на большее вывод, например, железистой секреции.
2 Hypertrophy снова пытается удовлетворить потребность в повышенных усилиях или выхода, не за счет пролиферации клеток, а за счет клеток в их исходном количество увеличивая их размер и, следовательно, содержание продуктивных органелл и материалы, д.g., гладкомышечные клетки матки при беременности.

6 Регенерация и физиологическая регенерация
l Физиологическая регенерация — это нормальный непрерывный процесс, например, в эпителии кишечника или постоянно, например, в эпителии волосяного фолликула, включая деление клеток для замещения клеток, потерянных естественным путем.
Это явление демонстрируют клетки крови, эпителиальные клетки, клетки костей и соединительной ткани. С другой стороны, мышечные, хрящевые и нервные клетки стабильны и статичны. клетки, в зрелости.
2 Ткани, регенерирующиеся физиологически без травм, лучше регенерируют для восстановления повреждений, чем те, которые имеют стабильные долгоживущие клетки.

ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ И СОЕДИНИТЕЛЬНЫЕ ТКАНИ
l Исходные события
Стерильный разрез на эпителии, который включает его собственную пластинку. будет:
.. (а) убить некоторые эпителиальные клетки,
.. (b) разрезать волокна CT, чтобы рана открылась;
.. (c) перерезать мелкие кровеносные сосуды, которые
.. (г) пролит кровь в щель.

2 Под эпителием
l Кровь образует сгусток с фибриновыми волокнами, тромбоцитами и фибронектином.
2 Лейкоциты мигрируют через неповрежденные стенки сосудов; полиморфы атакуют несколько бактерий и моноцитов удаляют остатки клеток и фибрин. (The воспалительная реакция и агенты, участвующие в ней, например, влияющие на капиллярные проницаемость и миграция лейкоцитов будут изучены при патологии и фармакология.)
3 Фибробласты в CT становятся активными, пролиферируют, мигрируют в сгусток, и закладывают новые волокна коллагена, гликопротеины и протеогликаны в конструкции грануляционная ткань .
4 Эндотелиальные клетки разрезанных капилляров одновременно пролиферируют и двигаться в сгусток, восстанавливая капиллярную сеть.
5 Продолжение деятельности по этим нескольким направлениям приводит к быстрому образование новой собственной пластинки.Между тем,

3 В эпителии
l Эпителиальные клетки по краям разреза мигрируют из в виде тонкого слоя, проникая в фибрин, и заменяя временную подложку из фибронектин и тенасцин с базальной пластинкой в ​​качестве надежной и постоянной поддержки.
2 Пока эпителиальная поверхность восстанавливается как тонкий лист, ее клетки начать умножить и дифференцировать , чтобы восстановить исходный толщина и разнообразие специализированных клеток эпителия.
3 Поскольку новый эпителий должен врастать с краев, степень зияние разреза определяет расстояние, на котором клетки должны мигрировать, а значит, и время, необходимое для исцеления. Порезанные края раны поэтому должны быть втянуты в стык с помощью швов. Чем раньше эпителий восстанавливается, тем раньше подлежащая ткань защищается от инвазия патогенными организмами.
Выше описана плавная, постепенная последовательность исцеления первым Сибирь .
4 Уцелевшая глубокая часть экзокринных желез может служить источником регенеративные эпителиальные клетки для замены поверхностного эпителия, кроме того к потерянной части железы. Показательные примеры:
(i) в физиологическом восстановлении слизистой оболочки матки от базального слой эндометрия после менструации;
(ii) замещение эпидермиса потовых желез (и волосяных фолликулов) после ожог второй степени убил более поверхностные эпителиальные клетки.

Хотя регенерацию эпителия и КТ лечили отдельно, в жизни эти процессы, да и их обычная повседневная работа тесно координируется цитокинами и взаимодействиями клеточного матрикса.

В общем, восстановление может восстановить как эпителий, так и его собственную пластинку. соединительной ткани почти в таком же хорошем состоянии, как и раньше. Когда есть патологическая задержка, цитокины пробуют, чтобы ускорить эпителиальный событиях и для ускорения строительства собственной пластинки.

C РЕМОНТ МАСШТАБА
Поскольку они состоят из эпителиальных клеток, железы могут иметь значительную регенеративная способность. Например:
l Печень , после асептического хирургического удаления половины ее вещества, может восполнить дефицит организованной гиперплазией и некоторой гипертрофией остаток.
2 Поджелудочная железа . Лигатура протока поджелудочной железы вызывает ферментативный разрушение большей части ацинарной ткани.Если лигатура отпущена до того, как эпителий протока будет убит, отрастание железистых ацинусов и островки могут происходить из эпителия протока.
3 Почки могут заменять эпителий канальцев, поврежденный, например, токсины, но утраченные или поврежденные клубочки не восстанавливаются.
D МЫШЕЧНАЯ РЕГЕНЕРАЦИЯ
л Скелетные мышцы
l Некоторая регенерация происходит на обрезанных концах волокон. (Сокращение недостаточное повреждение, чтобы убить клетку по всей ее длине.)
2 Концевой элемент возвращается к узкой стадии миотрубки , что видно в эмбриональном рост.
3 Сразу за сарколеммой неповрежденных мышечных волокон лежат сателлитов. клетки , которые действуют как остаточные периферические миобласты, способные реагировать на травма из-за превращения миобластов в активную.
4 Конец немного врастает в дефект, затем увеличивается в толщине. Если разрез не широкий, миотрубки, регенерирующие с каждой стороны, могут срастаться и восстановить волокна.
5 Глубокий разрез может перерезать нервов , нарушая регенерацию двумя способами:
.. (а) Денервация мышечных волокон снижает их регенеративную реакцию.
.. (b) КТ плотной фиброзной ткани затем заполняет промежуток и препятствует реинервации мышца.

2 Гладкая и сердечная мышца
l Радиоавтографические исследования показывают, что гладкомышечные клетки, например, в кишечника, способны к некоторой пролиферации для замены поврежденных клеток и частично восстановить преемственность в мышечной оболочке.
2 Сердечная мышца находится в невыгодном положении, поскольку не может расслабиться и отдохнуть на период, позволяющий деление клеток и реорганизацию мышц; и может быть ранний и неблагоприятный ответ от его КТ.
Точно так же легкое из-за своей эластичности и подвижности, а также других факторов не может эффективно работать. регенерация, несмотря на его эпителиальное содержание.
3 Срезы сердечной мышцы быстро заполняются с помощью КТ коллагена, но мышечные волокна, поврежденные инфекциями, могут восстанавливаться.
В общем, тогда большое мышечное поражение будет заполнено C.T. Только образуется небольшое количество новой мышечной ткани, чтобы заменить утраченную или заполнить пробелы. Выжившие мышечные волокна могут гипертрофироваться в попытке восстановить силу мышца в целом.

E Кость и хрящ
Если длинная кость конечности сломана, животное может добывать корм и убегание от хищников серьезно ограничено. Большинство животных, в том числе человек, в состоянии восстановить такие сломанные кости и снова использовать их для передвижения и других задачи..

l Перелом длинных костей (с участием стержня)
l Начальная фаза

  • (a) Костные края и костный мозг вдоль линии перелома отмирают, потому что кровь сосуды разорваны, что приводит к кровотечению в щель перелома.
  • (b) Надкостница отрывается от поверхности кости.
  • (c) Молодые кости могут ломаться, не повреждая надкостницу — так называемые перелом «зеленая палочка», но воспаление все равно возникает.
2 Ранний ремонт
  • (a) Лейкоциты и кровь капилляры растут, удаляя фибриновый сгусток и некротизированные мягкие ткани.
  • (b) Остеокласты местами размывают край мертвой кости.
  • (c) Фибробласты , из фиброзной надкостницы и прилегающей КТ, попытайтесь врастают в щель и образуют коллаген.
  • (d) Дальше от разрыва уцелевшие периостальные и эндостальные клетки становятся активными и закладывают новые кости и хрящи.
  • (e) Пролиферирующие остеобласты, хондробласты и фибробласты включают бластема .
3 Последующий ремонт
  • (a) Видно, что новая кость может быть положена на живую кость, мертвую кость, кальцинированный хрящ и как отдельно стоящие независимые трабекулы.
  • (b) Распределение новых твердых тканей, называемых каллусом , следующее:
    • (i) На эндостальной кости и в полости костного мозга в виде костного слоя и как трабекулы, вместе называемые внутренняя / эндостальная мозоль .
    • (ii) На живой кости вне диафиза в виде костного слоя и отдельно стоящие трабекулы и, ближе к оторванному краю, как быстро сформирована большая масса гиалинового хряща. Новая кость расширяется постепенно в хрящ в процессе эндохондрального окостенение, проявляющееся в развитии длинных костей.
      Эти объемные внешние ткани составляют наружных / надкостничных каллус .
4 Союз и не союз
  • (a) Если сломанные концы разделены только узкой щелью излома, Надкостничные и эндостальные мозоли, растущие с каждой стороны, могут встречаться и сливаться, в результате получается соединение .
  • (b) Однако в более широкой щели фибробласты могут расти и заполнять ее плотным фиброзная КТ.
  • (c) Фиброзное соединение ( несоединение ) уменьшает дальнейшее образование новых кость, и оставляет две части скелетной кости свободными для движения, то есть псевдоартроз образуется и может даже приобретать хрящ и синовиальная оболочка.
5 Консолидация
  • (a) Когда происходит слияние костных трабекул и гиалинового хряща, хрящ быстро замещается эндохондральной костью.
  • (b) Костные трабекулы (тканой кости) сначала заполняют полость костного мозга, пространство между кончиками костей и гордо возвышается над внешней поверхностью кость. Эта костная мозоль будет реконструирована:
    .. (i) для восстановления костного мозга изнутри,
    .. (ii) для уменьшения высокого контура наружной кости,
    .. (iii) в то же время, чтобы его плотность увеличилась за счет замены из плетеной кости за пластинчатой ​​костью.
2 Некоторые термины, используемые в клинической практике
Помните, что диафиз длинной кости имеет длинную ось:
  • (a) Один сломанный кусок кости может быть на смещен на от оси другое, или быть неуместным анатомически.
  • (b) Оси полученных двух частей не могут быть совмещены или параллельны: детали угловые .
  • (c) В месте перелома кость может расколоться на множество мелких фрагментов — измельчение излома.
  • (d) Эти костные фрагменты обычно погибают, но некоторые из их поверхностных клеток а соседние клетки образуют новую кость, которая удерживает мертвую кость в место, где его жесткая природа используется в качестве случайного костного трансплантата .Мертвая или живая кость может быть установлена ​​хирургическим путем в качестве преднамеренного трансплантата в разрыв трещины. Любой костный трансплантат используется в качестве временной твердой ткани, и в конечном итоге рассасывается и заменяется новой костью.
  • (e) В идеале не оставлять значительный зазор трещины, а вмешаться рано, чтобы подвести и удерживать концы костей в плотном прилегании, и правильно расположен. Эта процедура называется редукцией перелом.
3 Свод черепа (в сравнении с древком длинной кости)
l Начальная фаза по сути аналогична.
2 Ранний ремонт . Разница в том, что сохранившиеся костные поверхности (периостальный / перикраниальный, снаружи; дуральный, внутри свода) производят только небольшая новая кость и очень редко — хрящи. Фибробласты встречаются мало, чтобы помешать им заполнить пробел CT, который слишком мягкий, чтобы защитить мозг.

4 Хрящ
l Как и в случае с костью, восстановление ткани осуществляется за счет покрытия поверхности — надхрящница.
2 В молодости, когда он еще активен в аппозиционном росте, надхрящница может восстановить значительные дефекты.
3 В зрелом хряще дефекты, скорее всего, будут заполнены фиброзной КТ или поражение может ускорить дегенерацию прилегающего хряща.
При отсутствии перихондрия суставные поверхности особенно неспособны восстанавливать наносить ущерб. В терминальной стадии остеоартроза хрящ полностью изношен. прочь, оставляя болезненные царапающие концы костей.

ТКАНИ АССОРТИ
l Зуб .Эмаль , лишенная образующихся клеток при прорезывании, не подлежит ремонту. Дополнительный дентин может быть положен слой одонтобласта на поверхности пульпарной камеры дентина — снова пример реституции с поверхности.
2 Сухожилие . Фибробласты влагалища перерезанного сухожилия и другие источники размножаются, становятся активными и укладывают упорядоченные волокна коллагена, которые могут восстановить большую часть первоначальной прочности сухожилия.
3 Миелоидная и лимфоидная ткани
l Действие фагоцитарной фильтрации может осуществляться в других органах, если только один участник системы удален. Таким образом, спленэктомия оставляет костный мозг. и макрофагальные клетки печени с задачей обработки крови, например, удаления старые эритроциты, но создает уязвимость для определенных патогенов. Следовательно, хирурги пытаются восстановить разрыв селезенки.
2 Удаление миелоидных тканей грудины и черепа оставляет много костный мозг в других костях.Выживший костный мозг становится более активным и может повторно заселиться (проходя через кровоток) участки, лишенные кроветворной ткани.
Резкий спрос на новые эритроциты и гранулоциты может быть удовлетворен за счет возобновления миелопоэз в таких эктопических участках, как печень.
3 После уничтожения всех элементов, продуцирующих клетки крови, всем телом Рентгеновское облучение, активность может быть восстановлена ​​путем введения в кровоток изогенных клеток костного мозга.
G НЕРВНАЯ ТКАНЬ
См. Главу 11.F.2.
Уильям Бересфорд, факультет анатомии, медицинская школа, Запад Университет Вирджинии, Моргантаун, WV 26506-9128, США — — электронная почта: — [email protected][email protected][email protected] — факс: 304-293-8159

Frontiers | Метод количественной оценки способности эпителия колонизации патогенными бактериями

Введение

Исторически исследования микроорганизмов проводились на культурах, выращиваемых в жидком бульоне или на чашках с агаром.Однако традиционные лабораторные культуры редко отражают реальные условия роста в естественной среде обитания микроорганизмов. При выращивании в естественной среде обитания экспрессия генов и фенотипические характеристики часто значительно различаются (Brock, 1971; Branda et al., 2001; Kuthan et al., 2003; Palková, 2004). То же самое и с патогенными бактериями, которые колонизируют и проникают в организм человека (например, Smith, 1998; Krismer et al., 2014; Zapotoczna et al., 2016). Здесь иммунные эффекторы, ограниченная доступность питательных веществ и гидродинамические условия резко влияют на рост бактерий и заставляют их использовать альтернативные стратегии роста и активировать стрессовые реакции.

Типичной реакцией на такие стрессовые условия является образование бактериальной биопленки. Бактериальная биопленка привлекла большое внимание в последние десятилетия, что привело к созданию нескольких методов для изучения этой специфической реакции роста (Lebeaux et al., 2013; Azeredo et al., 2017). Такие модели обычно включают культивирование биопленок на абиотических поверхностях, таких как стекло или пластик, в некоторых случаях покрытых специфическими белками для имитации биологической поверхности (Djordjevic et al., 2002; Lembke et al., 2006).

Первым барьером хозяина, с которым сталкиваются вторгшиеся бактерии, часто являются эпителиальные слизистые оболочки, выстилающие внутренние трубчатые структуры тела. Для изучения способности вторгающегося патогена прилипать к этой внутренней поверхности обычно применяется так называемый статический анализ адгезии микротитровального планшета. В этом простом и высокопроизводительном методе бактерии добавляются к прилипшим культурам эпителиальных клеток с последующим центрифугированием для облегчения контакта бактерий с клетками. Наконец, прилипшие / инвазивные бактерии количественно оцениваются путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) на чашках с агаром (например,г., Берри и др., 2009; Letourneau et al., 2011). Это позволяет оценить функциональную силу адгезии клеток эпителия к бактериям. Однако этим методом можно исследовать только начальный контакт между клетками, поскольку совместное культивирование в статической системе приводит к быстрому истощению питательных веществ, чрезмерному росту бактерий и деградации культуры клеток.

Недавние исследования показали, что продолжительные эксперименты по бактериально-эпителиальной инфекции можно смоделировать с использованием моделей инфекции на основе проточной камеры.Такие модели облегчают изучение взаимодействия бактерий и эпителия под воздействием физиологического сдвига жидкости (Andersen et al., 2012; Alsharif et al., 2015; Khandige et al., 2016; Stærk et al., 2016). Кроме того, они индуцируют in vivo -подобных адгезионных стимулов у бактерий, а также возможность изучить влияние физиологического микроокружения на механизмы патогенеза (Andersen et al., 2012; Khandige et al., 2016). Хотя экспрессия специфических бактериальных генов и фенотипические изменения могут быть исследованы на таких моделях потока, они не были оптимизированы для точной количественной оценки развития бактериального укоренения и образования биопленок на слоях эпителиальных клеток.Бактерии могут быть извлечены из проточных камер через определенные промежутки времени для определения КОЕ. Однако для этого необходимо завершить довольно трудоемкий эксперимент, оставив только одну точку данных, измеренную на камеру. Более того, подсчет КОЕ бактерий, подвергшихся воздействию in vivo в условиях стресса, подобных , может быть затруднительным, поскольку бактерии могут изменять морфологию, то есть становиться нитевидными (Klein et al., 2015; Khandige et al., 2016) или агрегироваться (Loof et al., 2015; Grønnemose et al., 2017; Sønderholm et al., 2017) или замедлить скорость роста (Proctor et al., 2006), что может повлиять на точность количественного определения бактерий с помощью традиционных методов посева.

Здесь мы представляем метод, который позволяет обойти эти проблемы, обеспечивая точное и воспроизводимое количественное определение бактериальной колонизации на слоях эпителиальных клеток в физиологических гидродинамических условиях. Метод демонстрируется на трех моделях инфекции, имитирующих инфекцию мочевыводящих путей, кишечную инфекцию и инфекцию кровотока, вызванную важными патогенами человека; уропатогенный токсин и токсин шига Escherichia coli (UPEC и STEC соответственно) и Staphylococcus aureus .

Бактериальная колонизация культивируемых в проточной камере слоев уроэпителиальных, кишечных эпителиальных и эндотелиальных клеток определяется количественно на основе сигналов флуоресценции от прикрепившихся бактерий, которые конститутивно экспрессируют зеленый флуоресцентный белок (GFP). Покадровая микроскопия и количественная оценка бактериального покрытия выполняется в нескольких заранее определенных местах на слоях клеток для получения точных средних общих значений прогрессии роста, а также информации о структуре роста. Этот метод расширяет стандартный анализ адгезии бактерий к эпителию на основе микротитрационного планшета, включая условия гидродинамического стресса и непрерывный мониторинг колонизации бактериальной поверхности в течение продолжительных периодов времени.Кроме того, он открывает возможности для подробных исследований влияния известных или потенциальных факторов вирулентности, иммунных эффекторов или противомикробного лечения на прогрессирование инфекции. Здесь мы демонстрируем эту применимость в исследовании влияния фимбрий E. coli типа 1 (T1F) на адгезию / колонизирующую способность UPEC на слои клеток уроэпителия в потоке искусственной мочи. Хотя хорошо известно, что адгезин кончика T1F FimH взаимодействует с уроплакином на поверхности уроэпителиальных клеток и способствует адгезии / инвазии в мочевыводящие пути (Zhou et al., 2001; Bouckaert et al., 2006), его влияние на бактериальную колонизацию уроэпителия, насколько нам известно, не было определено количественно непосредственно при непрерывном мониторинге in vitro . Существующий метод однозначно позволяет проверить это в соответствующих физиологических условиях.

Материалы и методы

Бактерии, клетки и условия роста

Инфекция кишечника: продуцирование токсина шига Escherichia coli Колонизация слоев клеток кишечника (T84)

Слои клеток Т84, культивируемые в проточной камере (ATCC CCL-248), использовали для моделирования эпителия кишечника человека.Клеточная линия T84 представляет собой бессмертную линию эпителиальных клеток кишечника, полученную из метастазов в легких пациента с карциномой толстой кишки. Клетки Т84 субкультивировали в колбах Т25 (Nunc, Easy Flask, Delta Surface) при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 с использованием среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) / F-12 с GlutaMAX TM (Gibco ) с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки (FBS) (Sigma) и 1% пенициллин-стрептомицина (PS) (запас: 10.000 единиц / мл пенициллина, 10.000 мкг / мл стрептомицина, Gibco) в качестве среды для роста.Эксперименты проводились с использованием Т84 в пассажах 57-77. Клетки высвобождали из культуральных колб с использованием трипсин-ЭДТА (Sigma), ресуспендировали в 5 мл клеточной среды, из которых 150 мкл добавляли в проточные камеры (1 мкл-слайд I 0,6 Luer Collagen IV, Ibidi, Германия). Посеянным клеткам давали возможность осесть в течение 12 часов перед добавлением новой питательной среды. Среду для выращивания меняли каждые 24 часа до тех пор, пока клетки не достигли слияния <95%, обычно в течение 6-7 дней.

Штамм

STEC EDL933 был использован в качестве модельного кишечного патогена.EDL933 является изолятом серотипа O157: H7, первоначально выращенного из говяжьего фарша из Мичигана и связанного с множественной вспышкой геморрагического колита в США (Riley et al., 1983; любезно предоставлено доктором T. Shimizu). Все эксперименты с этим штаммом проводились на объектах, лицензированных Центром биозащищенности и биоподготовленности в соответствии с датским законом о биобезопасности (Закон № 474, 2008 г.).

Зеленый флуоресцентный EDL933 был получен путем трансформации плазмидой pMAN01, содержащей ген устойчивости к хлорамфениколу.Плазмида pMAN01 была сконструирована путем лигирования рестрикционного фрагмента EcoRV-SapI, содержащего транскрипционное слияние гена gfp + с промотором hsp60, полученным из pMN402 (Scholz et al., 2000), в pBAD33. Полученная плазмида кодирует сильную конститутивную экспрессию репортерного белка GFP +. Бактерии выращивали в бульоне Luria (Invitrogen, Miller’s LB Broth Base) с добавлением 30 мг / л хлорамфеникола (Sigma-Aldrich) при 37 ° C в течение ночи (ON) по 2-дневному режиму без встряхивания.Вкратце, 10 мкл культуры стационарной фазы добавляли в новый флакон после одной ночи инкубации, а затем вторую культуру ON использовали в качестве затравочной суспензии в проточных камерах. Для роста STEC в проточных камерах была составлена ​​модифицированная минимальная среда M9 в соответствии с Эльбингом и Брентом (2002) со следующими компонентами, добавленными в каждый литр дистиллированной воды: 6,0 г динатрийфосфата, 3,0 г монокалиевого фосфата, 1,0 г хлорида аммония, 0,5 г хлорида натрия, 2,0 г D-глюкозы, 1.0 г гидролизата казеина, 0,5 мг гидрохлорида тиамина (все от Sigma-Aldrich), 4,0 мг хлорида кальция · 2H 2 O, 0,228 г сульфата магния · 6H 2 O (оба от Riedel-de Häen AG). Смесь растворяли, pH доводили 5 М соляной кислотой до 6,6 (аналогично фекалиям; Rose et al., 2015) и стерильно фильтровали при 0,2 мкм перед использованием.

Инфекция распространенного кровотока: Staphylococcus aureus Колонизация слоев эндотелиальных клеток (EA.hy926)

Слои, культивируемые в проточной камере, линии EA эндотелиальных клеток человека.hy926 был использован для моделирования эндотелиальной поверхности, а Staphylococcus aureus ATCC 29213 был использован в качестве модельного патогена кровотока. Линия эндотелиальных клеток EA.hy926 (ATCC CRL-2922) представляет собой иммортализованное слияние эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) и клеток аденокарциномы легких человека A549. Клетки EA.hy926 культивировали в среде DMEM, содержащей 4,5 г / л D-глюкозы, 584 мг / мл L-глутамина, 110 мг / л пирувата натрия (Gibco) с добавлением 10% FBS и 1% PS в колбах для культивирования клеток T25. при 37 ° C с 5% CO 2 .Клетки EA.hy926 высвобождали снизу путем трипсинирования и субкультивировали при достижении 80% конфлюэнтности. 150 мкл 5 мл разделенных клеток повторно высевали в предметные стекла проточной камеры (μ-Slide I 0,6 Luer Collagen IV, Ibidi, Germany). Чтобы клетки EA.hy926 достигли 100% слияния, камерные культуры инкубировали в течение 2 дней при 37 ° C с 5% CO 2 . На второй день камеры были подключены к перистальтическому насосу и подвергались воздействию непрерывного потока клеточной среды (DMEM / 10% FBS) со скоростью 92 мкл / мин до следующего дня, чтобы позволить клеточному слою адаптироваться к условиям потока и промыть. антибиотики.Для всех экспериментов использовали вариант штамма S. aureus ATCC 29213, который конститутивно экспрессирует GFP под контролем стафилококкового blaZ-промотора (щедро предоставленного доктором Олегом Крутом Шнайтом и др., 2007). Перед заражением gfp -трансформированный S. aureus ATCC 29213 выращивали в стерильном фильтрованном триптико-соевом бульоне (TSB, Sigma), содержащем 30 мг / л хлорамфеникола, в течение 2½ часов при 37 ° C со встряхиванием для достижения экспоненциальной фазы. при которых экспрессия адгезинов повышена (Novick, 2003).Бактерии осаждали центрифугированием при 2000 g в течение 2 минут и ресуспендировали в 10% гепаринизированной плазме человека в течение 10 минут. Этот этап был выполнен для покрытия бактерий факторами свертывания крови человека и другими белками плазмы, таким образом имитируя опсонизацию / адсорбцию белка in vivo, , когда S. aureus попадает в кровоток. Затем суспензию еще раз центрифугировали при 2000 g в течение 2 минут и повторно суспендировали в 0,9% буфере NaCl до OD 600 нм 0.02. Аликвоту 700 мкл переносили в 69,3 мл DMEM / 10% FBS и использовали непосредственно в качестве посевной суспензии, что соответствует общему посевному материалу приблизительно 1,4 × 10 7 КОЕ.

Инфекция мочевыводящих путей: уропатогенная Escherichia coli Колонизация слоев уроэпителиальных клеток (HTB9)

В качестве уроэпителиальных клеток использовали клеточную линию ATCC HTB9, субкультивированную в колбах T25 при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO. 2 с использованием среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Gibco) с добавлением 10% FBS. и 1% PS в качестве питательной среды.Линия уроэпителиальных клеток ATCC HTB9 представляет собой бессмертную клеточную линию, полученную из карциномы мочевого пузыря человека. В качестве модели UPEC использовался штамм Escherichia coli UTI89, изолят серотипа O18: K1: H7, вызванный циститом, ранее использованный в нескольких исследованиях in vitro и in vivo на модели инфекции мочевыводящих путей (UTI) (Mulvey et al., 2001; Justice et al., 2004, 2006). Мутант с делецией UTI89Δ fimH был сконструирован, как сообщалось ранее (Andersen et al., 2012). Зеленые флуоресцентные варианты UTI89wt и UTI89Δ fimH были сконструированы путем трансформации плазмидой pMAN01, как описано выше для STEC EDL933. Для предварительного культивирования и роста UTI89 в проточных камерах использовалась искусственная моча (AU) в составе согласно Бруксу и Кивилу (1997). Вкратце, в каждый литр дистиллированной воды были добавлены следующие компоненты: 1,3 г хлорида аммония, 0,4 г лимонной кислоты, 2,1 г бикарбоната натрия, 5,2 г хлорида натрия, 10 г мочевины, 5 мг экстракта дрожжевого экстракта (все от Sigma-Aldrich. ), 0.37 г хлорида кальция · 2H 2 O, 0,454 г сульфата магния · 6H 2 O (оба от Riedel-de Häen AG), 3,2 г сульфата натрия · 10H 2 O, 1,2 г дикалий гидрофосфата (оба из Merck), 0,454 г сульфата железа II · 6H 2 O, 92 мкл молочной кислоты (оба из VWR), 0,8 г креатинина (Alfa Aesar), 1 г пептона L37 (Oxoid), 0,95 г дигидрофосфата калия (Fluka Chemika) и 0,07 г мочевой кислоты (AppliChem). Смесь доводили до pH 6,4 с помощью 5 M соляной кислоты и стерилизовали фильтрованием перед использованием.Мы рекомендуем хранить раствор в пластиковых контейнерах, так как хранение в стеклянных контейнерах может вызвать осаждение раствора по неизвестным причинам. Перед посевом в проточные камеры UTI89 предварительно культивировали в двухдневном режиме либо в бульоне Лурия (для стимуляции экспрессии T1F), либо в AU (для моделирования физиологических условий). Первоначальную культуру ON получали инокулированием колонии на чашке с агаром в 35 мл конкретной среды. На следующий день 10 мкл переносили в новый флакон со средой на 35 мл и инкубировали ON.

Инфекция клеточных слоев в проточной камере

Инфекции проточной камеры проводили в коммерческих проточных камерах типа Ibidi μ-slide 0,6 (Ibidi, Германия). Бактериальные штаммы, использованные в экспериментах, представлены в таблице 1.

Таблица 1 . Штаммы, использованные в исследовании.

В экспериментах с клетками T84 и HTB9 клетки выращивали до слияния в проточных камерах в статических условиях, как описано выше. Затем камеры были подключены к перистальтическому насосу (Ismatec IPC-N8, Glattbrugg, Швейцария) через стерильные силиконовые пробирки, и постоянный поток полной питательной среды составлял 200 мкл / мин в течение 2 дней при 37 ° C и 5% CO . 2 .При применении потока примерно 50% клеток смываются и медленно заменяются более устойчивым к потоку слоем клеток, который в конечном итоге достигает> 95% слияния в течение 2 дней. Перед заражением проточные камеры отсоединяли от насоса, и клетки промывали 10 раз сбалансированным солевым раствором Хэнка с добавлением хлорида кальция и хлорида магния (HBSS, Gibco) для удаления любых белков, полученных из среды. Затем клетки фиксировали инкубированием без протока в течение 1 ч в 10% нейтральном забуференном растворе формалина (Sigma, номер продукта HT-5011) при 37 ° C и 5% CO 2 и затем промывали еще 10 раз в HBSS для удаления формалин из проточных камер.Затем проточные камеры снова подсоединяли к насосу, и оставшийся формалин вымывали со скоростью 200 мкл / мин в течение 30 минут в проточной среде, используемой для последующих экспериментов по заражению. Затем клеточные слои инфицировали путем перфузии проточных камер бактериями, суспендированными в фосфатно-солевом буфере (PBS) (SSI Diagnostica) до оптической плотности (OD 600 ) 0,2, что соответствует приблизительно 1,6 × 10 8 КОЕ / мл. . Посевную суспензию пропускали через камеры со скоростью 100 мкл / мин в течение 20 минут, как описано ранее (Stærk et al., 2016). Затем к камере подсоединяли селективную среду (модифицированные M9 и AU, соответственно, с хлорамфениколом 30 мг / л для стабильности плазмиды pMAN01), и прилипшим бактериям позволяли колонизировать клеточный слой в течение 24 часов при скорости потока 50 мкл / мин (модифицированный M9 ) и 200 мкл / мин (AU) для изолятов STEC и UPEC соответственно.

При инфицировании S. aureus слоев клеток EA.hy926 бактериальную посевную суспензию (см. Выше) пропускали через камеру в течение 10 мин при скорости потока 6.4 мл / мин. Затем к камере были подключены новые стерильные пробирки, и в течение оставшегося времени эксперимента стерильная среда DMEM с 10% FBS прокачивалась через камеры в режиме последовательного потока, состоящего из 1 мин при расходе 6,4 мл / мин с прерыванием на 9 мин. пауза, перезапуск каждые 10 мин.

Количественная оценка поверхностной колонизации с помощью анализа изображений

Колонизацию проточных камер контролировали с помощью автоматической покадровой флуоресценции и фазово-контрастной микроскопии. С помощью микроскопа BX51 и программного обеспечения Olympus cellSens (версия 1.7) случайным образом было выбрано 11 отдельных положений в каждой проточной камере с общей площадью поверхности 10,23 мм 2 . Затем эти позиции были назначены диспетчеру экспериментов cellSens, и программное обеспечение было запрограммировано на последовательную съемку флуоресцентных изображений (GFP) и фазово-контрастных изображений всех 11 позиций каждые 20 минут в течение заранее определенного количества циклов. После завершения покадровой записи флуоресцентные изображения были проанализированы с помощью инструмента CellSens Count and Measure с использованием интервальных стробов для захвата флуоресцентных бактерий и исключения фонового сигнала.Покрытие в процентах было определено как значения области интереса (ROI). Графики развития бактериальной колонизации представляют средние значения от 3 до 4 отдельных экспериментов с проточной камерой ± одно стандартное отклонение (SD).

Статистический анализ

Тест суммы рангов Уилкоксона использовали для сравнения значений ROI UTI89wt, предварительно культивированного в LB, с UTI89wt, предварительно культивированным в AU, и UTI89Δ fimH , предварительно культивированным в LB. Используя поправку Бонферрони для 8 сравнений, p <0.006 (0,05 / 8) считались статистически значимыми. 95% доверительные интервалы (ДИ) были получены с использованием анализа начальной загрузки 10 5 повторов. Все анализы были выполнены в STATA версии 15.0 (StataCorp LLC, College Station, TX, USA).

Результаты

Экспериментальная установка

На рис. 1 показан эскиз экспериментальной установки. Для оптимальных условий культивирования клеток вся установка помещается в инкубатор CO 2 . Проточные камеры размещаются на высокоточном моторизованном предметном столике с компьютерным управлением под микроскопом.Получение изображений сконфигурировано для захвата изображений каждые 20 минут в 11 предварительно заданных местах в канале потока для получения репрезентативных средних значений прогрессии колонизации. После посева бактерий применяют стерильный прямоточный поток, чтобы специально контролировать способность первоначально засеянных бактерий увеличиваться в количестве на поверхности в условиях потока жидкости.

Рисунок 1 . Схема, показывающая экспериментальную установку, используемую для изучения бактериальной колонизации клеточных слоев.Применяется прямоточная установка со стерильной средой (A), , прокачиваемой через проточную камеру (B), с использованием высокоточного перистальтического насоса, расположенного после проточной камеры (C) . Проточная камера помещается на управляемый компьютером, моторизованный столик под микроскопом (D) , что позволяет регистрировать изображение инфицированного клеточного слоя (E) . Заранее определенные местоположения на слое клеток (F) контролируются с помощью покадровой фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии, с последующим извлечением данных и компьютерной обработкой кривых роста (G) .Вся установка хранится в инкубаторе для контроля температуры и уровней CO 2 .

В текущих экспериментах данные регистрировались за периоды времени от 24 до 26 часов и включали измерения количества и площади отдельных микроколоний, а также общий охват в процентах (ROI-%). На основании параллельных количественных оценок КОЕ на начальных этапах инфекции предел обнаружения был оценен примерно в 10 6 бактерий на камеру, и обнаруживаются только сгруппированные бактерии на стадии микроколонии.

STEC Колонизация слоев эпителиальных клеток кишечника

Колонизация кишечника прототипическим STEC серотипа O157: штамм H7 EDL933 моделировали с использованием клеточных слоев линии клеток T84 (рис. 2). Было обнаружено, что живые клетки T84 быстро дестабилизируются при заражении EDL933, вероятно, в результате секреции токсина Shiga посредством EDL933. Следовательно, в этой модели инфекции в качестве субстрата использовались фиксированные формальдегидом клеточные слои Т84. В качестве питательной среды использовали простую среду на основе М9 с добавлением глюкозы и казеина.Никакая питательная среда идеально не отражает фекалии из-за ее высокогетерологичного состава. Вместо этого мы выбрали эту относительно нейтральную среду, которая не содержит нерелевантных компонентов животного или дрожжевого происхождения. В то же время эта среда очень прозрачна, что обеспечивает высокое отношение сигнал / шум при регистрации сигналов флуоресценции из камеры.

Рисунок 2 . Колонизация штамма STEC EDL933 на фиксированных слоях эпителиальных клеток кишечника Т84 под током. (A) График, показывающий развитие бактерий на поверхности.Точки данных представляют собой средние значения бактериального покрытия в процентах с 20-минутными интервалами для четырех отдельных прогонов проточной камеры. Планки погрешностей представляют ± 1 стандартное отклонение между отдельными прогонами проточной камеры (показаны для ясности только с 1-часовыми интервалами). Значения в каждый 20-минутный момент времени, полученные при каждом запуске проточной камеры, представляют собой средние значения из записей в 11 положениях, каждое из которых представляет 1100 × 850 мкм на поверхности слоя клеток. График основан на 2 684 отдельных сканированиях. (B – D) Примеры данных изображения, записанных в одной репрезентативной позиции кадрирования 380 × 250 мкм.Фазово-контрастная микроскопия (Bi – Biv) , флуоресцентная микроскопия (Ci – Civ) и обнаруживаемое программным обеспечением покрытие (Di – Div) показаны в четырех конкретных временных точках. Эти временные точки отмечены пунктирными линиями в (A) , представляющими четыре фазы поверхностной колонизации; посев (½ ч; Bi , Ci , Di ), начальное укоренение на поверхности (5 ч; Bii , Cii , Dii ), стабилизация на поверхности (9 ч; Biii ) , Ciii , Diii ) и в установившемся режиме (17 ч; Biv , Civ , Div ).GFP, зеленый флуоресцентный белок; ч, часы; PH, фазово-контрастная микроскопия; ROI, регион интереса.

Спустя примерно 3 часа после инфицирования (hpi) рост EDL933 на слоях клеток T84 быстро увеличивался до значения ROI примерно 50% при 6 hpi. Как показано на фиг. 2B – D, рост начинается в виде спорадических микроколоний, диспергированных на слое клеток T84, которые медленно увеличиваются в размере, наконец приобретая вид биопленки. Начиная с 6 hpi и далее, более крупные комки материала биопленки иногда смываются с клеточного слоя, что приводит к кратковременному падению процента ROI во время эксперимента и более высоким значениям SD (Рисунок 2A, Рисунок S1).Это удаление материала биопленки временно замедляет рост до 17hpi, после чего рост стабилизируется почти на 100%.

Спорадический рост на поверхности привел к значительным отклонениям в покрытии биопленкой между микроскопическими изображениями, полученными во время фазы роста биопленки (отдельные проточные камеры проходят с полосами ошибок SD, указывающими на отклонение между отдельными захваченными изображениями, показаны на рисунке S1). Это подчеркивает необходимость извлечения средних значений из нескольких изображений в каждой проточной камере для оптимальной точности.Кривые кривых средних значений из отдельных прогонов были относительно схожими между экспериментами, демонстрируя воспроизводимость метода (рисунок S1 и обозначены полосами SD-ошибок на рисунке 2A).

Staphylococcus aureus Колонизация слоев эндотелиальных клеток

Метастатическая инфекция кровотока возникает, когда патогены кровотока распространяются через сосудистую систему и достигают отдаленных эндотелиальных или эндокардиальных участков. Здесь патогену удается прочно прикрепиться к эндотелию / эндокарду, несмотря на значительный сдвиг жидкости, за которым следует пролиферация и вторжение в подлежащую ткань (Edwards et al., 2010). Здесь мы установили экспериментальный протокол, основанный на установке количественной оценки флуоресцентной микроскопии, для мониторинга и количественной оценки адгезии и начальной колонизации слоев эндотелиальных клеток S. aureus в потоке жидкости. В качестве модельного патогена кровотока использовали штамм 29213 S. aureus ATCC и моделировали стенку сосуда / поверхность клапана сердца с использованием слоев эндотелиальных клеток EA.hy926, культивированных в проточной камере. Перед инфицированием S. aureus ATCC 29213 кратковременно обрабатывали плазмой крови человека для стимуляции опсонизации и белковой оболочки плазмы, которая образует in vivo (Ko et al., 2013; Claes et al., 2014). В качестве проточной среды использовали DMEM в 10% FBS для обеспечения источника белков крови, включая фибронектин, который важен для взаимодействия S. aureus с эндотелием (Edwards et al., 2010). Кроме того, использование этой среды позволяло проводить экспериментальную инфекцию как совместное культивирование с живыми слоями эндотелиальных клеток на протяжении всего эксперимента.

Моделирование напряжения сдвига сосудистой стенки требует высоких скоростей потока. В текущем эксперименте с инфекциями такое напряжение сдвига не может быть создано путем рециркуляции среды, так как это быстро приведет к неконтролируемому и непрерывному высеванию бактерий в камере, а также к быстрому истощению питательных веществ и накоплению отходов циркулирующие питательные среды.С другой стороны, использование непрерывного прямоточного потока при высоких скоростях потока неизбежно приводит к огромному расходу дорогостоящих сред в длительных экспериментах по заражению. В качестве компромисса мы решили использовать последовательный прямоточный поток, состоящий из 1 мин высокого потока (6,4 мл / мин), что дает напряжение сдвига стенки 2,77 дин / см 2 , прерываемое паузой в 9 минут, с последующим перезапуском цикла. Напряжение сдвига 2,77 дин / см 2 находится в пределах скоростей, обнаруживаемых в большом венозном и артериальном кровообращении (приблизительно от 1 до 12 дин / см 2 ; Papaioannou and Stefanadis, 2005).Несмотря на периоды отсутствия потока, периодическая последовательность высоких потоков гарантирует, что бактерии все еще будут вынуждены устанавливать контакт с поверхностью с такой же силой адгезии, как если бы использовался непрерывный поток.

При применении этого экспериментального протокола для изучения и количественной оценки адгезии и колонизации S. aureus на эндотелии, мы обнаружили, что бактерия проявляла значительную задержку в инициации поверхностной колонизации. Как показано на Рисунке 3, первые бактериальные колонии обнаруживаются через 12-15 hpi.Задержка колонизации поверхности одинакова между прогонами; однако кривые роста из отдельных прогонов проточной камеры показывают случайные большие падения общего покрытия в каждой камере в результате высвобождения больших комков биопленки после того, как они накапливаются на поверхности (для отдельных прогонов см. графики на Рисунке S2). Еще более выраженным для S. aureus по сравнению с STEC является спорадический рост, который происходил только в относительно небольшом количестве участков на эндотелиальной поверхности (данные не показаны).

Рисунок 3 . S. aureus Колонизация ATCC 29213 на живых слоях эндотелиальных клеток EA.hy926 под током. (A) График, показывающий прогрессирование роста бактерий на поверхности с точками данных, представляющими средние значения бактериального покрытия в процентах с 20-минутными интервалами из трех отдельных прогонов проточной камеры. Столбики ошибок представляют собой ± 1 стандартное отклонение между прогонами отдельных проточных камер (показаны для ясности с интервалом в 1 час). Значения в каждый 20-минутный момент времени, полученные при каждом запуске проточной камеры, представляют собой средние значения из записей в 11 положениях, каждая из которых представляет 1100 × 850 мкм на поверхности слоя клеток (на этом графике данные основаны на в общей сложности 2607 отдельных сканированиях). (Б – Д) . Пример данных изображения, записанных в одной позиции, представляющий обрезанную область размером 380 × 250 мкм с ростом выше среднего. Фазовый контраст — (Bi – Biv) , флуоресцентная микроскопия (Ci – Civ) и покрытие, определяемое программным обеспечением (Di – Div) , показаны в четырех конкретных временных точках (отмечены пунктирными линиями в A ) . GFP, зеленый флуоресцентный белок; ч, часы; PH, фазово-контрастная микроскопия; ROI, регион интереса.

S. aureus известен как высокоинвазивный, и вполне вероятно, что некоторая степень внутриклеточной колонизации присутствует в живых EA.слой клеток hy926, также на начальном этапе. Однако такие сигналы не улавливаются камерой микроскопа, возможно, из-за предела обнаружения примерно 10 6 КОЕ / камеру.

UPEC Колонизация слоев уроэпителиальных клеток

В предыдущих исследованиях мы исследовали взаимодействие UPEC со слоями уроэпителиальных клеток в проточных системах (Khandige et al., 2016; Stærk et al., 2016). Этот предыдущий подход позволил провести качественный микроскопических анализов in situ бактериальных фенотипов на клеточных слоях.Однако у него отсутствовала возможность количественно оценить способность бактерий прикрепляться к поверхности клеточного слоя и колонизировать ее при воздействии значительного сдвига жидкости. Здесь мы применили метод количественной оценки на основе флуоресценции для получения таких измерений. Искусственная моча (AU) использовалась в качестве проточной среды при скорости потока 200 мкл / мин, соответствующей напряжению сдвига стенки 0,08 дин / см 2 (скорость сдвига = 12,02 с -1 ). Это примерно в шесть раз выше, чем значение, использованное в более ранних исследованиях (2 с -1 , Andersen et al., 2012; Khandige et al., 2016; Stærk et al., 2016), и применяется в текущей модели, чтобы позволить прочности адгезии быть основным ограничивающим фактором для колонизации, что позволяет различать UPEC с недостатками адгезии / колонизации. Слои уроэпителиальных клеток в модели, продемонстрированной здесь, были зафиксированы до инфекции, чтобы сохранить полностью слившийся слой клеток во время инфекции и контролировать адгезию и поверхностную колонизацию без влияния клеточных инвазивных событий.

Подобно EDL933, UTI89 демонстрирует начальную лаг-фазу (рисунок 4).Однако, как только UTI89 начинает рост, охват увеличивается с высокой экспоненциальной скоростью, пока не приблизится к 100%. В отличие от биопленок S. aureus ATCC 29213 и STEC EDL933, биопленка UPEC UTI89 оказалась очень стабильной с потерей биомассы в основном в виде планктонной формы отдельных бактерий, а не скоплений биопленки (на основе анализа покадровой микроскопии). развитие биопленки). Из-за эффективного засева наблюдался относительно равномерно распределенный рост UPEC по всей поверхности, что приводило к небольшому отклонению между изображениями, полученными в отдельных прогонах проточной камеры (обозначено полосами ошибок SD на рисунке 4).Разброс между отдельными прогонами в проточной камере был очень низким, что свидетельствует о хорошей воспроизводимости.

Рисунок 4 . Колонизация штамма UPEC UTI89 на фиксированных слоях уроэпителиальных клеток HTB9 в потоке искусственной среды мочи. Четыре отдельных прогона проточной камеры показаны вместе, чтобы визуализировать высокую степень воспроизводимости от эксперимента к эксперименту. В каждой проточной камере наблюдали за одиннадцатью участками размером 1100 × 850 мкм в течение 24 часов. Планки погрешностей указывают ± 1 стандартное отклонение. ROI, регион интереса.

Оценка роли адгезии, опосредованной фимбриями 1 типа, в колонизации UPEC слоев уроэпителиальных клеток

T1F и его концевой адгезин FimH являются одними из наиболее всесторонне изученных факторов вирулентности UPEC и, как полагают, способствуют уроэпителиальной адгезии и колонизации мочевыводящих путей человека. Исследования показали, что T1F облегчает адгезию к уроэпителиальным клеткам человека и увеличивает вирулентность in vivo , на основании статических анализов клеточной адгезии и моделей инфицирования мышей (Connell et al., 1996; Райт и др., 2007). Однако сообщенная низкая экспрессия fim генов in vivo поднимает вопросы о регуляции и важности T1F во время ИМП (Lim et al., 1998; Hagan et al., 2010).

Для оценки влияния T1F-опосредованной адгезии на способность UTI89 колонизировать уроэпителий в условиях, отражающих среду мочевыводящих путей, штамм UTI89, удаленный в гене fimH (без функционального T1F), был проанализирован с использованием текущего метода и по сравнению с UTI89wt / pMAN01.Этот результат показал резкое влияние T1F на способность UPEC устанавливать контакт и колонизировать уроэпителий (рис. 5). Начало колонизации UTI89Δ fimH откладывается примерно на 6 часов по сравнению с UTI89wt (предварительно культивированный LB), и как только начинается рост, UTI89Δ fimH демонстрирует примерно в 18 раз большее время удвоения площади поверхности с окончательным охватом, достигающим только приблизительно 57 % через 24 часа (рисунок 5 и таблица 2).

Рисунок 5 .Колонизация UPEC UTI89 на фиксированных слоях уроэптелиальных клеток HTB9 под током. (A) График, показывающий прогрессирование бактериального роста на поверхности посредством UTI89wt, предварительно культивированного в LB (красная линия), UTI89wt, предварительно культивированного в AU (зеленая линия), и UTI89Δ fimH , предварительно культивированного в LB (синяя линия) ). Точки данных представляют собой средние значения бактериального покрытия в процентах с 20-минутными интервалами для трех отдельных прогонов проточной камеры. Столбики ошибок представляют собой ± 1 стандартное отклонение между прогонами отдельных проточных камер (показаны для ясности с интервалом в 1 час).Значения в каждый 20-минутный момент времени, полученные при каждом запуске проточной камеры, представляют собой средние значения из записей в 11 положениях, каждая из которых представляет 1100 × 850 мкм на поверхности клеточного слоя (на графике данные собраны из 8640 отдельных сканирований). (B – D) Пример данных изображения, записанных в одной репрезентативной позиции кадрирования 380 × 250 мкм. Фазовый контраст ( Bi – Biv, Ei – Eiv, Hi – Hiv ), флуоресцентная микроскопия ( Ci – Civ, Fi – Fiv, Ii – Iiv ) и покрытие, определяемое программным обеспечением ( Di – Div, Gi – Giv , Ji – Jiv ) показаны в четырех конкретных временных точках.Они отмечены пунктирными линиями в (A) , представляющими различные фазы поверхностной колонизации. Покрытие UTI89wt, предварительно культивированного в LB и AU, значительно различается через 5 и 9 часов после посева ( p <0,001, отсутствие перекрытия 95% ДИ). Покрытие UTI89wt и UTI89Δ fimH значительно различается через 5, 9 и 17 часов после посева ( p <0,001, отсутствие перекрытия 95% ДИ). GFP, зеленый флуоресцентный белок; ч, часы; PH, фазово-контрастная микроскопия; ROI, регион интереса.

Таблица 2 . Математические модели роста биопленки в экспоненциальной фазе.

В предыдущих исследованиях мы и другие продемонстрировали, что UTI89 и другие штаммы UPEC, выращенные планктонно в моче, демонстрируют очень низкую экспрессию T1F (Lim et al., 1998; Roos et al., 2006; Reisner et al., 2014; Greene et al. ., 2015; Stærk et al., 2016). В этом более раннем исследовании мы обнаружили, что низкий уровень T1F-положительных бактерий в моче существенно не влияет на способность UPEC образовывать биопленку на материале катетера (Stærk et al., 2016). Здесь мы хотели оценить, влияет ли низкий уровень T1F-положительного UPEC в моче на способность UPEC инициировать поверхностную колонизацию уроэпителия.

UTI89wt предварительно культивировали в искусственной моче (AU), что приводило в основном к T1F-отрицательным бактериям, аналогичным культивированию в реальной моче (данные не показаны). Затем эти бактерии высевали на слои клеток HTB9 в проточной установке и позволяли колонизировать поверхность в потоке AU. На фигуре 5А показано, что предварительно культивированный AU UTI89 значительно подавлен в своей способности колонизировать поверхность уроэпителия с отсроченным началом колонизации и в 3 раза более длительным временем удвоения площади после перехода роста в экспоненциальную фазу (таблица 2).В конце концов, предварительно культивированная популяция AU закрепляется и, наконец, достигает примерно 100% покрытия поверхности примерно через 14 часов.

В таблице 2 показаны наклоны функций наилучшего соответствия, описывающих кривые роста для трех препаратов UPEC, проанализированных на рисунке 5A (см. Рисунок S3 для линий, соответствующих ln-преобразованным данным). Различие в кинетике колонизации отражает различные ограничения способности бактерии увеличивать свою биомассу, связанную с поверхностью, в применяемых условиях.Быстрое время удвоения площади для UTI89wt, предварительно культивированного в LB, вероятно, в основном ограничено скоростью его репродукции, поскольку дочерние клетки в значительной степени удерживаются на поверхности за счет прочного T1F-опосредованного поверхностного закрепления. В результате получается кривая роста, напоминающая обычное культивирование в бульоне. С другой стороны, колонизация и наращивание биопленки, демонстрируемые UTI89Δ fimH , почти уравновешиваются значительной потерей дочерних клеток в поток, что приводит к очень медленному увеличению биомассы, связанной с поверхностью.

Эффективность посева бактерий

Способность бактерии эффективно закрепляться на данной поверхности под воздействием сдвигового напряжения жидкости зависит от ее способности изначально прилипать к поверхности, а также от способности прикрепившихся бактерий размножаться на поверхности (колонизация). Последнее зависит от баланса между размножением на поверхности и потерей бактериальных клеток в поток.

Поскольку микроскопический мониторинг роста в представленной установке подсчитывает отдельные события (микроколонии), записанные данные можно использовать для оценки того, насколько эффективно данная бактерия прилипает к поверхности и образует микроколонии на начальной стадии.На рисунке 6 показано количество событий, подсчитанных во время фаз роста различных бактерий и бактериальных препаратов, проанализированных в текущем исследовании. UTI89wt, предварительно культивированный в LB, показал очень эффективный посев, достигая средних значений более 1600 микроколоний на контролируемый участок вскоре после посева, число, которое впоследствии уменьшается из-за слияния колоний (рис. 6А). T1F-отрицательный UTI89wt, предварительно культивированный в AU, достиг лишь примерно половины числа прикрепленных микроколоний на своем пике по сравнению с UTI89wt, предварительно культивированным в LB.Меньшее количество микроколоний, образовавшихся первоначально, и задержка начала роста объясняют более медленную скорость колонизации UTI89wt в применяемых условиях. Связанная с поверхностью биомасса, генерируемая UTI89Δ fimH , возникает из еще меньшего количества первоначально прикрепившихся бактерий. Более того, они демонстрируют более медленное увеличение роста, вероятно, вызванное значительной потерей дочерних клеток в поток, что приводит к низкой общей эффективности посева во время установления биопленки.

Рисунок 6 . Эффективность бактериального посева. Графики, показывающие среднее общее количество микроколоний (событий), обнаруженных в подобластях 1100 × 850 мкм в каждую 20-минутную временную точку во время экспериментов по заражению тремя различными патогенами. Данные для каждого типа экспериментов были объединены из всех проведенных экспериментов с проточной камерой. Пики указывают на максимальное количество бактерий, которым удается создать микроколонию после первоначального посева. (A) Штаммы UPEC UTI89wt и UTI89Δ fimH , выращенные на слоях уроэпителиальных клеток в потоке искусственной мочи (AU).UTI89wt предварительно культивировали в AU или LB перед экспериментом, как указано. (B) Рост STEC на эпителиальных клетках кишечника (T84). (C) Колонизация S. aureus на слоях эндотелиальных клеток (EA.hy926).

Штамм STEC EDL933 создал примерно такое же количество микроколоний, что и UTI89wt, предварительно культивированный в LB, но достиг пика в более поздний момент времени после заражения. Кроме того, большое количество обнаруженных микроколоний сохранялось в течение более длительного периода времени по сравнению с UTI89wt, предварительно культивированным в LB.Это указывает на трудности, с которыми сталкивается эта бактерия при формировании стабильных биопленок со слиянием микроколоний в применяемых условиях. В целом STEC EDL933 показал промежуточную эффективность посева. Лишь немногие бактерии S. aureus ATCC29213 были способны прилипать и инициировать пролиферацию в применяемых условиях высокой скорости потока (рис. 6С), при этом относительно небольшое количество колоний расположено слишком далеко друг от друга, чтобы эффективно слиться в биопленку в течение 24 часов.

Обсуждение

Необратимое прикрепление и пролиферация на эпителиальных поверхностях барьера хозяина является важным первым шагом в патогенезе многих инфекционных заболеваний (Finlay and Falkow, 1997; Pizarro-Cerdá and Cossart, 2006; Ribet and Cossart, 2015).Инвазия на участки слизистой оболочки требует, чтобы бактерия прочно прилегала к поверхностным слоям клеток и увеличивалась в количестве, сопротивляясь непрерывному движению жидкостей на этих участках. Для точного моделирования этого процесса in vitro требуется система, которая позволяет бактериям взаимодействовать с соответствующими слоями эпителиальных клеток человека в контролируемых гидродинамических условиях и в соответствующих средах.

Исследования адгезии бактерий к эпителиальным клеткам обычно проводят с культивированными клеточными линиями на микротитровальных планшетах (Albert et al., 2000). Однако в последние годы исследования адгезии, проводимые в проточных устройствах, начали набирать обороты. Такие анализы позволяют лучше контролировать напряжение сдвига жидкости, а также контролировать процесс адгезии с помощью микроскопии. Область, в которой этот подход нашел все более широкое применение, — это анализ взаимодействия между патогенами кровотока и эндотелиальными клетками. Здесь моделирование физиологических условий потока во время бактериальной адгезии значительно расширило понимание патогенеза этого типа инфекции (Pappelbaum et al., 2013; Liesenborghs et al., 2016; Claes et al., 2017). Что касается диссеминированных инфекций S. aureus , инфекции, вызываемые Escherichia coli , обычно развиваются в местах, где необходимо преодолеть значительное напряжение сдвига жидкости, чтобы бактерия могла успешно заразить хозяина. Изучая адгезию бактерий и клеток-хозяев в модели потока, Томас и его коллеги обнаружили, что основной адгезин E. coli , FimH, функционирует как датчик силы, который увеличивает силу адгезии к уроэпителию, когда бактерия подвергается сдвигу жидкости (Thomas и другие., 2002). Бактериальная адгезия в проточных моделях также использовалась, чтобы показать, что Borrelia burgdorferi прилипает к эндотелию и отделяется от него под действием потока подобно лейкоцитам, катящимся по сосудистой стенке (Ebady et al., 2016), и что это прикрепление включает рекрутирование фибронектина, тем самым связывая бактерии с эндотелиальной стенкой (Niddam et al., 2017). Кроме того, было показано, что адгезия Neisseria meningitidis к эндотелиальным клеткам зависит от вызванного бактериальным ворсом IV ремоделирования эндотелиальной плазматической мембраны, позволяющего бактериям противостоять силам сдвига сосудов (Mikaty et al., 2009; Soyer et al., 2014).

Вышеупомянутые исследования начальной адгезии ясно демонстрируют важность введения физиологически релевантного потока жидкости в исследованиях взаимодействия бактерий и эпителия. Хотя начальная адгезия имеет решающее значение, способность бактерии увеличиваться в количестве на поверхности слизистой оболочки является следующей проблемой, которую необходимо преодолеть для успешного установления инфекции. Чтобы смоделировать эти события, необходимы продолжительные эксперименты по заражению, и, особенно когда используются слои живых клеток человека, должна быть создана среда, в которой культура клеток человека будет жизнеспособной, несмотря на присутствие намного быстрее растущих бактерий.

Только в нескольких более ранних исследованиях сообщалось о моделях, позволяющих отслеживать имитацию эпителиальной инфекции в течение продолжительных периодов времени (часы). Mairey et al. и Soyer et al. продемонстрировали модели потока, используемые для изучения взаимодействия Neisseria meningitides со слоями эндотелиальных клеток в течение нескольких часов. Эта модель была использована для исследования адгезии, колонизации и последующего отсоединения от этих клеточных слоев, а также для изучения влияния напряжения сдвига на способность бактерии взаимодействовать с капиллярами мозга (Mairey et al., 2006; Soyer and Duménil, 2011 ) . Alsharif et al. недавно продемонстрировали модель кишечной инфекции STEC, в которой штамм STEC O157: H7 Sakai совместно культивировали на прикрепленных клетках HeLa в токе в течение до 4 часов, демонстрируя повышенную регуляцию генов центральной вирулентности в результате адгезии клеток-хозяев при сдвиге жидкости ( Alsharif et al., 2015 ) . Используя микрофлюидное устройство, Kim et al. сообщили о модели совместного культивирования клеток HeLa и STEC, которые были использованы для демонстрации того, что микроокружение биопленок комменсалов является ключевым фактором инфекционности STEC (Kim et al., 2010 ) . В недавно созданной модели, описанной Tremblay и соавторами, также использовалось микрофлюидное устройство для исследования способности различных патогенных E. coli колонизировать слои эпителиальных клеток кишечника (Tremblay et al., 2015 ) . В исследовании был продемонстрирован протокол, который поддерживал первоначальное образование микроколоний STEC на слое кишечных клеток в течение 16 часов и количественную оценку роста STEC на основе анализа изображений флуоресцентной микроскопии фиксированных слоев инфицированных клеток после завершения эксперимента.

Используя специально созданную установку проточной камеры, мы ранее продемонстрировали модель инфекции мочевыводящих путей с совместными культурами UPEC и уроэпителиальных клеток, что позволило нам воспроизвести основные элементы уропатогенеза E. coli , которые ранее наблюдались только у животных. модели (Andersen et al., 2012; Khandige et al., 2016).

В текущем исследовании мы демонстрируем экспериментальную методологию, которая позволяет проводить длительные анализы инфекции и прямую in situ количественную оценку прогрессирования бактериальной колонизации слоев эпителиальных клеток под током.Представлены три модели инфекции, две из которых используют фиксированные слои уроэпителиальных или кишечных клеток для моделирования UPEC и STEC инфекции мочевыводящих путей и кишечника, соответственно. Третья модель позволяет исследовать адгезию и колонизацию S. aureus на слоях живых эндотелиальных клеток в условиях высокого потока, тем самым моделируя ключевой этап диссеминированной инфекции кровотока. Методология была специально разработана для обеспечения точной и чувствительной оценки эффективности колонизации с течением времени и для лучшей оценки важности конкретных эндогенных или экзогенных факторов в способности бактериальных патогенов колонизировать типичные места входа в человеческий организм-хозяин.

Хотя STEC не является как таковым, считается образующим биопленку, он действительно содержит большое количество специфических генов, которые вносят вклад в поверхностную колонизацию и образование биопленок (Puttamreddy et al., 2010). В нашем исследовании мы обнаружили, что штамм STEC EDL933 действительно является твердым образующим биопленку, который эффективно колонизировал эпителиальный слой кишечника человека в течение 24-часового эксперимента. В данном случае использование фиксированных слоев клеток было необходимо для предотвращения опосредованного токсинами уничтожения клеточного слоя, однако стимулы адгезии, вероятно, все еще будут индуцироваться в бактериях, поскольку фиксированные клетки сохраняют значительное количество поверхностных антигенов (Yu et al., 2014). Однако следует подчеркнуть, что использование фиксированных слоев клеток обеспечивает только физиологическую поверхность субстрата для роста бактерий, без дальнейшего взаимодействия клетки-хозяина и бактерии, которое, как известно, происходит in vivo (Lai et al., 2013). При необходимости, исследования, посвященные этим событиям, например, бактериальной деградации эпителия, возможны с использованием вместо этого живых слоев эпителиальных клеток и подходящей клеточной среды. Это можно, например, комбинировать с регистрацией сигналов флуоресценции от репортерных штаммов генов вирулентности.

Модель должна быть полезна для выяснения влияния конкретных факторов вирулентности на эффективность кишечной колонизации, а также для исследований конкуренции с комменсальными бактериями или более клинически ориентированных исследований эффекта лечения антибиотиками. Последнее особенно важно в случае кишечной инфекции STEC, поскольку, как сообщается, лечение антибиотиками увеличивает риск гемолитико-уремического синдрома у пациентов с этим типом инфекции (Freedman et al., 2016). Здесь модель представляет собой подходящий инструмент in vitro для идентификации более подходящих схем лечения, которые в меньшей степени вызывают экспрессию генов вирулентности.

Эндотелиальную колонизацию S. aureus проводили с живыми эндотелиальными клетками с использованием DMEM + FBS в качестве проточной среды. Из-за содержания FBS эта среда содержит белки крови, которые используются S. aureus для адгезии, такие как фибронектин. Следует отметить, что мы получили предварительные результаты, показывающие, что этот метод можно проводить с живыми эндотелиальными клетками, используя разбавленную плазму человека в качестве единственного источника питательных веществ.Это обеспечивает еще более физиологически правильную среду, которая поддерживает рост S. aureus и жизнеспособность эндотелия, а также содержит фибриноген и компоненты коагуляции, которые используются S. aureus для образования тромботических биопленок (Grønnemose et al., 2017).

Представленная здесь модель уроэпителиальной инфекции была проведена с использованием линии уроэпителиальных клеток HTB9 и прототипа изолята цистита UTI89. Основываясь на морфологии, HTB9 представляет собой линию дифференцированных клеток на относительно конечной стадии, которая обеспечивает клеточный слой, который сильно поддерживает адгезию и инвазию UPEC (неопубликованные данные).Недостатком является то, что HTB9 относительно хрупок в условиях высокого потока и, следовательно, требует фиксации для использования в текущем анализе. Если для дальнейшего изучения взаимодействий UPEC-уроэпителий необходимы живые клетки, клеточную линию PD07i (Klumpp et al., 2001) можно использовать в анализах потока без фиксации, поскольку она более устойчива к потоку (Andersen et al., 2012) и остается сливаться после продолжительных экспериментов по инфекции в потоке мочи (Klein et al., 2015). PD07i, однако, является относительно недифференцированной клеткой, больше похожей на лежащие в основе уротелиальные клетки в многослойной слизистой оболочке мочевого пузыря и, вероятно, по этой причине, менее поддерживает адгезию / инвазию UPEC (собственные неопубликованные данные).Чтобы клетки PD07i находились в устойчивом к потоку недифференцированном режиме роста, его поддерживают в специальной и дорогой бессывороточной среде с низким содержанием кальция (Thumbikat et al., 2009), что значительно увеличивает затраты на эксперименты, особенно в условиях высокой скорости потока. используются. Следует также отметить, что эксперименты по заражению с потоком мочи несовместимы с текущим подходом к количественной оценке колонизации с использованием флуоресцентной микроскопии, поскольку моча демонстрирует сильную автофлуоресценцию. Искусственная моча (AU), используемая в данном исследовании, демонстрирует лишь очень ограниченную аутофлуоресценцию и, в отличие от образцов мочи, не различается по содержанию и концентрации.Хотя AU сконфигурирован так, чтобы точно имитировать химический состав мочи (Brooks and Keevil, 1997) и имеет тот же эффект, что и реальная моча на подавление экспрессии T1F, в более ранних исследованиях мы обнаружили, что AU не оказывает такого же эффекта на рост UPEC, когда речь идет об индукции изменений морфологии бактерий (Klein et al., 2015), которые могут влиять на колонизацию поверхности.

Чтобы продемонстрировать применение методологии, мы исследовали влияние T1F на способность UPEC колонизировать слои уроэпителиальных клеток.Важность T1F в адгезии / инвазии уроэпителиальных клеток хорошо описана в исследованиях статических клеточных культур (Martinez et al., 2000; Zhou et al., 2001; Martinez and Hultgren, 2002; Eto et al., 2007). ) и исследования на мышах (Connell et al., 1996; Bahrani-Mougeot et al., 2002). В текущем исследовании мы проверили влияние T1F на весь прогресс от начальной адгезии до образования биопленки на уроэпителиальной поверхности в течение 24-часового периода времени под потоком AU. Этот эксперимент подтвердил более ранние исследования, показавшие значительное влияние T1F как на адгезию, так и на колонизацию UPEC на уроэпителиальной поверхности.

Роль T1F во время ИМП у людей была связана с некоторыми обсуждениями, поскольку T1F экспрессируется в ограниченной степени in vivo (Lim et al., 1998; Hagan et al., 2010) и, вероятно, только среди поверхностно-ассоциированных субпопуляции (Stærk et al., 2016). Эксперименты, проведенные в более раннем исследовании, чтобы проверить, влияет ли отсутствие T1F на UPEC в планктонном состоянии в посеве мочи на способность UPEC образовывать биопленку на материале катетера, не показали значительной разницы в полученных 8-часовых биопленках (Stærk et al. ., 2016). Однако при колонизации уроэпителия UPEC связывается с уроэпителиальными клетками посредством специфической адгезии рецептор-лиганд посредством связывания адгезина T1F FimH, специфически с уроплакинами на поверхностных уроэпителиальных клетках (Wu et al., 1996). Таким образом, можно ожидать, что отсутствие T1F в UPEC, растущем в моче, значительно замедлит способность бактерий связывать и колонизировать уроэпителий. В нашем анализе это было подтверждено, показывая задержку на 6–10 часов в поверхностной колонизации в основном T1F-отрицательными UTI89 дикого типа, которые были предварительно культивированы в AU.Эта задержка хорошо соответствует ранее описанной задержке транскрипционной активации оперона fim , которая была впервые обнаружена через 8-12 часов после начальной адгезии (Stærk et al., 2016). Активация оперона может быть результатом механизма поверхностного зондирования, который передает внутриклеточный сигнал, способствуя переключению промотора переключателя fim в положение ON. Альтернативно, это может быть результатом избирательной адгезии нескольких T1F-положительных UTI89, которые закладывают основу для последующей T1F-положительной поверхностной популяции.Дополнительные эксперименты, например, со штаммом fim GFP-репортер, изученным в представленной установке, должны позволить дальнейшее выяснение этого механизма.

В заключение, представленная методология делает возможным подробный анализ способности колонизации бактериального эпителия и открывает возможности для непрерывного исследования взаимодействий исходных клеток-хозяев и патогенов. Следующим шагом в эволюции моделей для воспроизведения взаимодействий между эпителием и бактериями является контроль роста дифференцированных слоев эпителиальных клеток, т.е.g., позволяя отшелушивать клетки и выращивать 3D-культуры, а также моделировать слизистые слои, которые в некоторых нишах, таких как кишечник, являются первым веществом, с которым сталкиваются кишечные патогены. В сочетании с добавлением иммунных клеток и факторов гуморального иммунного ответа можно будет моделировать реакции на инфекцию и воспаление с еще большей точностью. Помимо предоставления более подробных сведений о взаимодействиях хозяина и патогена, это позволит ученым лучше связать экспериментальные модели in vitro с моделями инфекции животных.

Авторские взносы

Идея и дизайн исследования были разработаны RP, RG и TEA. Экспериментальные работы выполнены RP, TBA и CA. Написание рукописи было выполнено RP, RG, KS, HK, JM-J и TEA. Все авторы были вовлечены в обсуждение и интерпретацию результатов на всех этапах подготовки рукописи.

Финансирование

Это исследование было поддержано грантом докторантуры университетской больницы Оденсе номер 901, грантом доктора философии региона Южной Дании номер 13/7117 и грантом фонда Лундбек номер R164-2013-16181.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Тину Кронборг за техническую помощь в создании штаммов GFP E. coli . Мы также благодарим доктора О. Крута, доктора Т. Симидзу и доктора Д. Дж. Клумппа за предоставление штаммов бактерий для этого исследования.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2018.00016/full#supplementary-material

Список литературы

Альберт, М. Дж., Грант, Т., и Робинс-Браун, Р. (2000). «Изучение бактериальной адгезии к культивируемым клеткам», в Справочник по бактериальной адгезии , ред. Я. Х. Ан и Р. Дж. Фридман (Тотова, Нью-Джерси: Humana Press), 541–552.

Google Scholar

Альшариф, Г., Ахмад, С., Ислам, М. С., Шах, Р., Басби, С. Дж., И Крахлер, А. М. (2015). Присоединение хозяина и сдвиг жидкости интегрированы в механический сигнал, регулирующий вирулентность в Escherichia coli O157: H7. Proc. Natl. Акад. Sci. США 112, 5503–5508. DOI: 10.1073 / pnas.1422986112

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Андерсен, Т. Э., Хандиге, С., Маделунг, М., Брюер, Дж., Колмос, Х. Дж., И Мёллер-Йенсен, Дж. (2012). Escherichia coli уропатогенез in vitro : инвазия, ускользание от клеток и вторичная инфекция проанализированы на модели инфицирования клеток мочевого пузыря человека. Заражение. Иммун. 80, 1858–1867. DOI: 10.1128 / IAI.06075-11

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Азередо, Дж., Азеведо, Н. Ф., Бриандет, Р., Черка, Н., Коенье, Т., Коста, А. Р. и др. (2017). Критический обзор методов биопленки. Крит. Rev. Microbiol. 43, 313–351. DOI: 10.1080 / 1040841X.2016.1208146

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Bahrani-Mougeot, F. K., Buckles, E. L., Lockatell, C. V., Hebel, J. R., Johnson, D. E., Tang, C. M., et al. (2002).Фимбрии типа 1 и внеклеточные полисахариды являются главными уропатогенными детерминантами вирулентности Escherichia coli в мочевых путях мышей. Мол. Microbiol. 45, 1079–1093. DOI: 10.1046 / j.1365-2958.2002.03078.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст

Берри, Р. Э., Клумпп, Д. Дж., И Шеффер, А. Дж. (2009). Уротелиальные культуры способствуют формированию внутриклеточного бактериального сообщества с помощью уропатогенной Escherichia coli . Заражение.Иммун. 77, 2762–2772. d

Гистопатология глазной поверхности

Меланоцитарные поражения конъюнктивы имеют широкий спектр нарушений. Они варьируются от доброкачественных до очень злокачественных смертельных опухолей. В следующих подразделах будут обсуждаться наиболее распространенные дифференциальные диагнозы меланоцитарных поражений конъюнктивы.

3.2.1. Невус конъюнктивы

Невус конъюнктивы — наиболее распространенные меланоцитарные опухоли конъюнктивы. Конъюнктивальные невусы обычно начинают появляться у детей или подростков в виде группы пигментированных клеток в базальном слое конъюнктивального эпителия.Невусы конъюнктивы чаще встречаются у кавказцев (89%), реже страдают африканцы (6%) и азиаты (5%) [33]. Конъюнктивальные невусы обычно пигментированы, но примерно 16% могут быть амеланотическими или частично пигментированными [12, 34]. Юкста-лимбальная локализация — наиболее частая локализация у более чем двух третей пациентов. Другие локализации включают мясистую часть, полулунную складку, свод, предплюсну и роговицу [34, 35].

Существует три типа невусов конъюнктивы в зависимости от их гистологического расположения: составные, субэпителиальные и узловые невусы встречаются реже.Сложные невусы характеризуются наличием меланоцитарных клеток в эпителиально-субэпителиальном соединении и в строме (рис. 6). Субэпителиальные поражения располагаются исключительно в субэпителиальной области. Они часто связаны с включениями эпителия кистами и бокаловидными клетками (рис. 7). Соединительные невусы состоят из гнезд клеток невуса на эпителиально-субэпителиальном соединении. Они редки, за исключением детей. Эти типы считаются скорее фазами миграции клеток невуса из базального эпителия в строму конъюнктивы.

Рисунок 6.

Гистопатологический вид сложного невуса конъюнктивы с гнездами клеток невуса у основания эпителия конъюнктивы и внутри собственной субстанции (исходное увеличение × 50, гематоксилин и эозин).

Рисунок 7.

Гистопатологический вид субэпителиального невуса конъюнктивы с кистозными областями, выстланными конъюнктивальным эпителием и бокаловидными клетками в собственном веществе (первоначальное увеличение × 100 периодической кислоты-Шиффа).

Злокачественная трансформация оценивается как <1% [21, 35]. Однако новое начало в среднем возрасте или более позднем возрасте, необычное расположение (например, свод, предплюсна, карункул, складка), большие поражения более 10 мм в диаметре, выступающий питающий сосуд или внутренняя васкуляризация с кровотечением, некистозные поражения и неподвижные очаги поражения (т. е. прикрепленные к подлежащей эписклере) являются клиническими показаниями для удаления очага [36].

3.2.2. Меланоз, связанный с цветом лица (CAM)

CAM, также известный как расовый меланоз, представляет собой доброкачественное двустороннее поражение конъюнктивы, обнаруживаемое у лиц с темной пигментацией [8, 12].Обычно это наблюдается в перилимбальной области и редко в своде или конъюнктиве век. При осмотре наблюдаются некистозные плоские образования различной пигментации.

3.2.3. Первичный приобретенный меланоз (PAM)

PAM определяется как пролиферация меланоцитов в эпителии конъюнктивы. Это чаще встречается у людей со светлой кожей и обычно одностороннее. Обычно это коварно начинается в среднем возрасте. Воздействие солнечного света может быть фактором риска развития ПАМ.Это может происходить из-за аномалии нервного гребня, как это также наблюдалось у пациентов с нейрофиброматозом [37].

Он представляет собой плоскую коричневую, поверхностную, некистозную, одиночную, пятнистую, диффузную или многоочаговую пигментацию, охватывающую бульбарную, сводную и конъюнктиву глазного яблока или роговицу. Изредка можно увидеть амеланотический ПАМ [8, 21, 38]. Клеточная атипия, определяемая биопсией и тщательным гистопатологическим исследованием, с помощью иммуногистохимического окрашивания (с использованием окраски мелан-А для выделения меланоцитов), является основным фактором риска прогрессирования меланомы (рисунки 8 и 9).В одном исследовании 311 глаз с PAM поражения без атипии или с легкой атипией продемонстрировали 0% прогрессирование в меланому. С другой стороны, 13% пациентов с ПАМ с тяжелой атипией прогрессировали в меланому [21].

Рисунок 8.

Гистопатологическое проявление первичного приобретенного меланоза конъюнктивы (PAM) с пролиферацией меланоцитов в основании эпителия конъюнктивы без признаков атипии (исходное увеличение × 200 гематоксилин и эозин).

Рисунок 9.

Иммуногистохимическое окрашивание другого случая первичного приобретенного меланоза конъюнктивы (PAM), четко показывающего пролиферацию меланоцитов в основании эпителия конъюнктивы без признаков атипии (исходное увеличение × 200 Мелан-A).

Клинические показания для выполнения биопсии включают диаметр поражения ≥5 мм, прогрессирование, утолщение, появление узелка, васкуляризацию, поражение конъюнктивы глазного яблока или роговицы, пациентов с личным или семейным анамнезом синдрома диспластического невуса и анамнезом глазного или экстраокулярная меланома [12].

3.2.4. Меланома конъюнктивы

Меланома конъюнктивы, хотя и встречается редко, представляет собой второе по частоте злокачественное поражение конъюнктивы после плоскоклеточного рака [39]. В прошлом его развитие почти всегда приводило к неблагоприятному прогнозу, что приводило к экзентерации орбиты в попытке искоренить высокоинвазивное заболевание. Он представляет собой проблему для клинициста и патолога, потому что он может присутствовать на нескольких изображениях и возникает из явно доброкачественных поражений, таких как невусы конъюнктивы [40].Меланома конъюнктивы чаще всего поражает белых людей с частотой от 0,24 до 0,80 на 1 000 000 населения [41, 42]. Это чаще встречается у пожилых людей со средним возрастом от 55 до 70 лет [41, 42, 43, 44, 45, 46, 47]. Хотя это и редко встречается у молодых людей, имеются сообщения о случаях меланомы конъюнктивы у пациентов в возрасте до 20 лет [48, 49]. Существенной разницы между мужчинами и женщинами нет [41, 42, 43, 44, 45, 46, 47].

Меланома конъюнктивы возникает из-за ПАМ в 75% случаев, предшествующего невуса в 20% и de novo в 5% [8, 12].К системным факторам риска относятся синдром диспластического невуса, нейрофиброматоз и пигментная ксеродермия [38]. Воздействие солнечного света также считается причиной развития бульбарной меланомы конъюнктивы. Наиболее частым локализацией меланомы конъюнктивы является бульбарная конъюнктива в перилимбальной области, но она может возникать в любом месте, например, на конъюнктиве глазного яблока или конъюнктивы, складках или в области карункула [45, 47, 50, 51].

Клинически меланома конъюнктивы может иметь различные формы.Классически это проявляется в виде образования или повышенного пигментного поражения конъюнктивы. В некоторых случаях он может казаться более диффузным или множественным, с плохо определенными границами, особенно когда он связан с PAM [22]. Реже меланома конъюнктивы может проявляться в виде розового или красноватого пигментного поражения или даже быть амеланотической, что затрудняет распознавание и, таким образом, задерживает диагностику и лечение [47]. Более того, рецидив меланомы конъюнктивы после иссечения обычно является амеланотическим [12].Повторяющийся и постоянный контакт конъюнктивы с меланомой края соседнего века может вызвать вторичную меланому конъюнктивы (имплантационная меланома) [52]. Как и SCC, меланома конъюнктивы классифицируется в соответствии с классификацией AJCC-TNM. Меланомы конъюнктивы могут метастазировать регионально в преурикулярные и подчелюстные лимфатические узлы. Отдаленные метастазы поражают мозг, печень, кожу и кости [53].

Меланоцитарная интраэпителиальная неоплазия конъюнктивы (C-MIN) — это термин, используемый для описания поражений, демонстрирующих пролиферацию меланоцитов.Оценка C-MIN основана на нескольких факторах, включая характер горизонтального и вертикального эпителиального поражения, степень клеточной атипии, ядерный и клеточный диаметр, а также наличие ядрышек и митотических фигур. Затем C-MIN оценивается от 0 до 10, где 0 соответствует отсутствию какой-либо пролиферации меланоцитов или атипии (т.е. только меланоз), 1–4 соответствуют тяжести PAM (то есть легкой, средней и тяжелой атипии). и 5–10, соответствующие меланоме конъюнктивы in situ (рис. 10) [54].

Рис. 10.

Гистопатологический вид меланомы конъюнктивы in situ с атипичной пролиферацией меланоцитов, охватывающей всю толщину эпителия конъюнктивы (исходное увеличение × 200 периодической кислоты-Шиффа).

Поражения обычно демонстрируют атипичную пролиферацию меланоцитов, характеризующуюся обильной цитоплазмой, выступающими ядрышками и атипичными митотическими фигурами с инвазией в нижележащую строму конъюнктивы, а также прилегающий эпителий.Атипичная пролиферация меланоцитов может быть ограничена эпителием на ранних стадиях в случаях, возникающих в результате PAM (меланомы in situ) с радиальным распространением, аналогично кожным меланомам. Поражение должно быть удалено целиком, не касаясь его, иссекая его вдоль лимба, чтобы предотвратить посев опухолевых клеток в хирургической области.

Патологическое исследование иссеченного поражения должно включать наблюдение таких важных характеристик, как изъязвление, толщина опухоли и преобладающий гистологический тип клеток (т.е., эпителиоид или веретено) и фаза вертикального роста. Другие важные характеристики включают лимфоцитарную инфильтрацию, сосудистую или периневральную инвазию и митотическую активность, определяемую с помощью индекса Ki-67. Кроме того, следует также наблюдать микроскопический сателлитоз, определяемый как отдельные опухолевые гнезда, отделенные от основной злокачественной массы [55].

Очевидные гистопатологические особенности, которые связаны с худшей выживаемостью, включают толщину опухоли более 2 мм, наличие язв, эпителиоидную морфологию, более высокое количество митотических фигур (> 1 / мм 2 ), лимфоваскулярную инвазию и микросателлитоз [55, 56].Экстрабульбарная меланома конъюнктивы, как обнаружено в исследовании с многофакторным анализом, связана с плохим исходом [57].

Иммуногистохимические (ИГХ) окрашивания меланоцитов, таких как мелан-А красный, MART-1, белок S-100, HMB-45 и маркер пролиферации клеток Ki-67, могут помочь в выявлении проблемных случаев меланоцитов. В меланоме конъюнктивы иммуногистохимическая экспрессия HMB-45 и Ki-67 выше, чем то, что наблюдается в PAM или невусах конъюнктивы [58]. Бета-катенин — это маркер ИГХ, который более сильно экспрессируется в меланомах конъюнктивы по сравнению с невусами и PAM.Таким образом, его роль в меланоме конъюнктивы отличается от меланомы кожи, при которой потеря экспрессии бета-катенина связана с более агрессивным течением [58]. Белок запрограммированной гибели клеток 1 (PD-1) и его взаимодействие с его лигандом PD-L1, исследованные у пациентов с меланомой конъюнктивы, показали повышенный риск отдаленных метастазов и худшую выживаемость при экспрессии опухолью [59].

BRAF — это человеческий ген, кодирующий белок B-Raf, протоонкоген. Меланома конъюнктивы является одним из злокачественных новообразований, связанных с мутацией BRAF.Более высокая вероятность отдаленных метастазов может наблюдаться в меланомах конъюнктивы, экспрессирующих мутации BRAF. Меланома конъюнктивы и меланома кожи демонстрируют сходство по значимости этого типа мутации и ее значимости для клинической картины [57, 60].

Похожие записи

Полиморфная аденома околоушной слюнной железы послеоперационный период: Полиморфная аденома околоушной слюнной железы послеоперационный период – Здоровье полости рта

Содержание Полиморфная аденома околоушной слюнной железы послеоперационный период – Здоровье полости ртаО заболеванииДля чего предназначен органПричиныРазновидностиФормы и видыЛокализацияКлиническая картина и […]

Ожог сетчатки глаза сваркой: симптомы, чем лечить, чего нельзя делать

Содержание Ожог сетчатки глаза — последствия, симптомы, лечениеГде и как можно получить ожог сетчаткиСтепени ожога сетчаткиСимптомы ожогаЛечениеПолезное видеоЧто еще почитатьОжоги […]

Можно ли делать шугаринг во время месячных в зоне бикини: Можно ли делать шугаринг во время месячных в зоне бикини и глубокого бикини

Содержание Можно ли делать шугаринг во время месячных в зоне бикини и глубокого бикиниЭпиляция в критические дниЭпиляция домаЭпиляция в салоне […]

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *