Clc синдром что это: Синдром CLC на ЭКГ, его причины, первая помощь и лечение

alexxlab Разное

Содержание

Что такое синдром CLC | Доктор САН

Распространение электрического импульса в сердце по дополнительным проводящим путям называют синдромом предвозбуждения желудочков. Одной из его разновидностей является синдром CLC – по фамилиям авторов, которые его описали.

Сущность данного нарушения проводимости в следующем. В норме импульс проходит путь от предсердий к желудочкам через предсердно-желудочковый узел. В области этого соединения происходит физиологическое, то есть нормальное, снижение скорости движения импульса.

При синдроме CLC импульс идет в обход предсердно-желудочкового соединения. При этом задержка импульса не может быть обеспечена, поскольку проводящие свойства дополнительных путей все же отличаются от основного тракта.

Такое электрическое явление связано с врожденной аномалией проводящей системы сердца. У данной группы пациентов в миокарде имеются видоизмененные клетки, которые способны провести импульс, минуя главный путь его распространения.

При более полном обследовании таких пациентов у многих не удается обнаружить каких-либо структурных изменений сердца. У других диагностируют врожденные пороки сердца, кардиомиопатии и другие аномалии развития сердечно-сосудистой системы.

Отличие синдрома CLC от других видов преждевременного возбуждения желудочков в том, что здесь импульс приходит на клетки проводящей системы желудочков. Пусть и делает это окольным путем. В то время как при синдроме WPW возбуждается сразу рабочий миокард желудочков.

С этой особенностью связаны кардиографические признаки синдрома CLC в сравнении с другими подобными состояниями. Единственное его проявление – это укорочение предсердно-желудочкового интервала на ЭКГ. Более грубых изменений, как при других видах предвозбуждения, не регистрируется.

У большинства пациентов синдром CLC (как основное заболевание) не имеет клинических проявлений. Развитие жизнеугрожающих аритмий, как при других вариантах предвозбуждения желудочков, для него менее характерно. Однако пациент должен быть проинформирован об имеющейся у него аномалии проводящей системы, более тщательно следить за своим здоровьем и чаще других контролировать электрокардиограмму.

Такой вид исследования, как чреспищеводная электрокардиостимуляция, даст возможность однозначно ответить на вопрос: имеются ли у конкретного пациента риски, связанные с синдромом CLC. Выбор тактики ведения пациента также зависит от результатов этого исследования.

Синдром (CLC, LGL): проведение импульса по пучку Джеймса

Синдром L–G–L (Лауна – Ганонга – Левине), или CLC (Клерка– Леви– Кристеско) характеризуется укорочением интервала PQ (PQ<0,12 с), нормальной формой и продолжительностью комплекса QRS и наклонностью к приступам суправентрикулярных тахиаритмий. При этом синдроме возбуждение, по-видимому, обходит атриовентрикулярный узел по пучку Джеймса и отсутствует задержка в проведении импульса по атриовентрикулярному узлу, существующая в норме, что и приводит к укорочению интервала PQ. Распространение возбуждения по желудочкам при синдроме L–G–L не нарушено, поэтому комплекс QRS, сегмент ST и зубец Т не изменены. Для выяснения природы наблюдаемых при этом изменений может помочь ЭКГ пучка Гиса. Синдром L–G–L отмечается преимущественно у мужчин среднего возраста при отсутствии органических заболеваний сердца.

Установлено, что укорочение интервала PQ (PQ меньше 0,11 с) наблюдается у 2% здоровых людей. Короткий интервал PQ может быть при гиповитаминозе В (болезнь бери-бери), гипертиреозе, артериальной гипертонии, активном ревматизме, инфаркте миокарда, хронической ишемической болезни сердца, повышенной возбудимости сердца и т.д. По данным Д. Ф. Преснякова, Н. А. Долгоплоска, укороченный интервал PQ может быть ранним признаком хронической ишемической болезни сердца.

Преждевременное возбуждение желудочков нередко является частью проявлений синдромов W–Р–W или L–G–L. Однако эти термины не являются синонимами.

Следует учитывать, что для больных с синдромами W–Р–W и L–G–L характерны приступы пароксизмальных тахиаритмий, которые обычно отсутствуют при изолированном укорочении интервала PQ. Теоретически любой вид нарушения функции атриовентрикулярного узла, который в норме осуществляет задержку проведения возбуждения к желудочкам, приводит к укорочению интервала PQ.

Основное различие между синдромами W–Р–W и L–G–L – это форма комплекса QRS, нормальная при синдроме L–G–L. У больных обеих групп имеется наклонность к возникновению пароксизмальных тахиаритмий. У большинства этих больных признаки заболевания сердца отсутствуют или слабо выражены.

Не всегда дополнительные пути в сердце так безобидны. Дело в том, что наличие дополнительного пути всегда увеличивает шанс развития некоторых аритмий, при которых пульс может достигать более 180-200 ударов в минуту. И если у молодых такое состояние редко приводит к существенным последствиям, то у старшего поколения пациентов, с сопутствующей патологией сердца, такая аритмия всегда потенциально опасна.

Что делать, если у вас выявлен CLC синдром

Первым делом не нужно паниковать, особенно если кроме изменений на ЭКГ у вас нет, и никогда не было приступов сердцебиения с частотой более 180 ударов и потери сознания. Тем не менее, существует одно исследование, которое может с большой вероятностью предсказать даст ли о себе знать CLC в будущем или так и останется случайной находкой на ЭКГ. Называется это исследование ЧПЭКС – ЧреспПищеводная ЭлектроКардиоСтимуляция.

ЧПЭКС позволяет определить способность аномального пути проведения проводить импульс с большой частотой. Так если дополнительный путь не сможет провести импульсы с частотой, к примеру, более 100-120 в минуту, то волноваться по поводу него нечего. Если же при ЧСПЭК окажется, что пучок способен пропускать импульсы с частотой более 170-180 в минуту или еще хуже – в процессе обследования запуститься аритмия, то с большой вероятностью потребуется специализированное лечение.

Речь идет о хирургическом лечении – катетерной абляции, потому что медикаментозное лечение синдрома CLC, как и синдрома WPW, в 99,9% случаев оказывается неэффективным.

Синдромы предвозбуждения желудочков

Синдром предвозбуждения желудочков — это преждевременное возбуждение желудочков, которое связано с патологией развития проводящей системы сердца. Это не заболевание, а клиническое проявления врождённой патологии, связанной с образованием ещё во внутриутробном развитии, дополнительных путей, проводящих импульс от предсердия к желудочкам. Не стоит путать с экстрасистолией, которая характеризуется внеочередным сокращением желудочка, связанного с образованием внеочередного импульса в любой части проводящей систем вне синусового узла. Синдром предвозбуждения желудочков может быть причиной развития экстрасистолии, мерцательной аритмии, трепетания желудочков и так далее.

В медицинской литературе встречается два мнения относительно данного синдрома. Одни считают, что наличие дополнительных проводящих путей, вне зависимости от проявления, уже является синдромом предвозбуждения желудочков. Другая же часть авторов, склоняются к тому, что если не наблюдается развитие пароксизмальной тахикардии, то патологию стоит называть лишь как “феноменом предвозбуждения”. И соответственно синдромом можно считать только в том случае, если возникают пароксизмы наджелудочковой тахикардии.

 

Патогенез синдромов предвозбуждения желудочков

Причина синдрома в аномальном распространении по миокарду импульса возбуждения в следствии наличия дополнительных патологических проводящих путей, полностью или частично «шунтирующих» АВ-узел. Это приводит к тому, что часть или весь миокард начинает возбуждаться раньше, недели при обычном распространении от по АВ-узла к пучку Гиса и дальше по его ножкам.

На сегодня известны следующие патологические проводящие АВ-пути:
— Пучки Кента, в том числе и скрытые ретроградные. Они связывают предсердие и желудочки.
— Пучки Джеймса. Они соединяют синусовый узел и нижнюю область АВ-узла.
— Волокна Махейма. Они соединяют АВ-узел или с межжелудочковой перегородки в правой её области или с правой ножкой пучка Гиса. Иногда волокна Махейма соединяют ствол пучка Гиса и правый желудочек.

— Тракт Брешенманше. Он соединяет правое предсердие и ствол пучка Гиса.
Виды синдрома предвозбуждения желудочков

В клинической кардиологии на сегодня различают два вида синдрома:

  • Синдром Вольффа-Паркинсона-Уайта (WPW-синдром или Wolff-Parkinson-White). Характеризуется укороченным интервалом в P-Q(R), незначительная деформация и уширение QRS и образование дополнительной дельта-волны, а также изменение зубца Т и сегмента ST. Чаще встречается при аномальном АВ-проведении пучка Кента. Существует целый ряд типов данного вида синдрома, а также интермиттирующий (перемежающийся) и транзиторный (переходящий). Некоторые авторы, вообще выделяют аж до десяти подтипов WPW-синдрома.
  • Синдром Клерка-Леви-Кристеско (синдром короткого интервала PQ или CLC-синдром). В английских источниках его именуют как синдром Lown-Ganong-Levine (LGL-синдром). Характеризуется также укороченным интервалом P—Q(R), но без изменения комплекса QRS. Обычно возникает при аномальном АВ-проведении пучка Джеймса.


Симптомы

Сам синдром никак себя не проявляет. Человек может жить долго и счастливо, даже не подозревая, что у него есть патологический дополнительный проводящий путь в сердечной мышце. Первые признаки могут возникнуть в любом возрасте, как правило на фоне другого заболевания, при чём не обязательно миокарда. Это могут быть, например любые инфекционные болезни.


У пациентов с CLC-синдромом часто первые проявления начинаются с пароксизмальных тахикардий.

WPW-синдром проявляется следующими нарушениями ритма:


— Наджелудочковые реципрокные тахикардии, которые с возрастом переходят в мерцательную аритмию. Данное проявления WPW-синдрома встречается у 80% пациентов.
— Пароксизмальных тахиаритмии встречаются у 75% пациентов с WPW-синдромом.
— Фибрилляция встречается у 15-30% людей с WPW-синдромом.
— Трепетание или мерцание предсердий встречается у 5% пациентов.

Диагностика синдромов предвозбуждения желудочков

Основным методом диагностики является ЭКГ. Обычно уже на ЭКГ чётко видны характерные признаки. Для определения вида и типа синдрома назначают:
— ЭКГ с нагрузкой,
— Мониторирование по Холтеру,
— Монополюсное поверхностное ЭКГ-картирование,
— Эхокардиография,
— ЭФИ (электрофизиологическое исследование миокарда),
— ЧПСС (чреспищеводное стимулирование миокарда).


Лечение

Если пароксизмы отсутствуют, то лечение не проводится. В других случаях используют медикаментозное лечение, которое должен назначит специалист в зависимости от ситуации. Препараты всегда подбираются индивидуально с учётом патологии, сопутствующих заболеваний и других индивидуальных особенностей организма.
Если медикаментозная терапия не приносит желаемого эффекта, назначают электроимпульсную терапию, то есть проведение электрокардиостимуляции.
Из радикальных методов лечения используют радиочастотную катетерную абляцию с целью деструкции патологических путей. На сегодня это единственный метод, который в 95 % случаев имеет положительный результат. Конечно есть и свои осложнения, а смертность составляет 1% из всех случаев. Перед абляцией пациент должен обязательно пройти ЭФИ.


Прогноз

Сильно зависит от тяжести синдрома, наличии осложнений и побочных заболеваний. Но даже в самых тяжёлых случаях, проведение качественной высокочастотной абляции во многом улучшает прогноз. Многое также зависит от больного: здоровый образ жизни, выполнение всех рекомендаций врача, своевременное обращение к специалисту.

консультация кардиолога

Другие статьи по кардиологии:
  • Недостаточность митрального клапана — классификация и причины
  • Пролапс митрального клапана
  • Митральный стеноз
  • Пороки сердца — классификация, диагностика, лечение и прогноз
  • Внутрижелудочковые блокады
  • Холтеровское мониторирование ЭКГ: общие сведения
  • Экстрасистолия: причины, классификация, диагностика, лечение, прогноз
  • Тахикардия: виды, причины, симптомы, диагностика, лечение
  • Брадикардия: описание, симптомы, диагнотика, лечение
  • Трепетание предсердий
  • Мерцательная аритмия
  • Диагностика и лечение сердечной недостаточности
  • Сердечная недостаточность классификация и клинические проявления
  • Сердечная недостаточность: причины, патогенез, общее описание
  • Профилактика стенокардии
  • Вариантная стенокардия
  • Стенокардия покоя
  • Лечение стенокардии
  • Диагностика стенокардии
  • Стенокардия напряжения или стабильная стенокардия. Симптомы
  • Осторожно! Высокое давление
  • Ишемическая болезнь сердца (ИБС)
  • Миокардиты (острые и хронические)
  • Острый инфаркт миокарда
  • Холтеровское мониторирование АД и ЭКГ: показания к применению и технология использования
  • Стенокардия. Общие сведения
  • Нарушение ритма сердца — общее описание и причины
  • Как проходит холтеровское мониторирование АД
  • Электрокардиография
  • Нужна ли вам консультация кардиолога?

Синдром CLC: краткая характеристика, симптомы, терапия

Синдром CLC, известный как синдром Лауна-Ганонга-Левине, встречается приблизительно у 0,5% населения и является причиной тахикардии в 30% случаев, именно поэтому стоит узнать, как диагностировать наличие синдрома и как бороться с ним.

Описание

Синдром Клерка-Леви-Кристеско является частным случаем синдрома преждевременного возбуждения желудочков сердца, который характеризуется проведением возбуждения к желудочкам по дополнительным путям. Сердце человека устроено так, чтобы желудочки сокращались позднее предсердий, это необходимо для достаточного наполнения их кровью. Функционирование данного механизма обеспечивается атриовентрикулярным узлом, который находится между желудочками и предсердиями, в нём импульс идёт гораздо медленнее, что и обеспечивает задержку в сокращении желудочков. Однако у некоторых людей есть врождённые аномальные пути, проводящие импульс в обход атриовентрикулярного узла, к таким проводящим путям относятся пучки Джеймса, пучки Кента и волокна Махейма. Благодаря этим путям время прохождения импульса сокращается и возникает феномен CLC. Этот механизм можно заметить, проводя анализ ЭКГ. Сам феномен никак не влияет на функционирование сердца и проявляется только на кардиограмме. Но иногда встречаются случаи, когда возникает круговой ход возбуждения. Это происходит, когда, пройдя по аномальному пути, импульс возвращается через атриовентрикулярный узел или наоборот – пройдя по основному пути, возвращается по аномальному. Всё это вызывает изменение в ритме биения сердца, именно этот процесс и называется синдромом CLC.

Феномен и синдром CLC являются врождёнными, доподлинная причина появления этих аномалий неизвестна. Есть предположения, что это связано с нарушениями в развитии плода на этапе формирования сердца. Также не стоит исключать, что причина может быть и в генетических нарушениях.

Анализ кардиограммы

Анализ ЭКГ помогает выявить этот синдром. Он характеризуется сокращением интервала P-R (P-Q). Данный интервал показывает время, за которое возбуждение доходит до миокарда желудочков по предсердиям и атриовентрикулярному соединению. У людей старше 17 лет нормальным является интервал 0,2 с, однако сокращение этого интервала, которое может вызвать тахиаритмию, также может быть предпосылкой к диагностированию синдрома CLC. Так как признаком синдрома Клерка-Леви-Кристеско является одноимённый феномен, характеризующийся прохождением импульса по аномальному каналу – пучку Джеймса, соединяющему предсердие с дистальной частью атриовентрикулярного соединения, что и вызывает сокращение интервала P-R (P-Q).

Кроме сокращения упомянутого интервала, при наличии синдрома CLC на ЭКГ нет других изменений. Желудочковый комплекс (комплекс QRS – самое значительное отклонение на кардиограмме, показывающее время прохождения возбуждения внутри желудочков) не выглядит аномально. Синдром CLC чаще всего встречается у людей, сердце которых не имеет отклонений.

Симптомы

Феномен Клерка-Леви-Кристеско не имеет никаких проявлений, большинство людей, имеющих пути Джеймса, даже не знают о них и живут, не испытывая дискомфорта.

Признаки CLC как синдрома заключаются в изменении сердечного ритма. У больного возникают внезапные приступы ускоренного сердцебиения, которые могут сопровождаться вздутием живота, обмороками, головокружением и шумом в голове. Иногда можно наблюдать повышенное потоотделение и обильное мочеиспускание до или после приступа. Также может наблюдаться ускоренное неритмичное биение сердца.

Лечение

В большинстве случаев синдром CLC не требует специализированного вмешательства. Во время приступов сердцебиения больной самостоятельно может их остановить при помощи специального массажа, охлаждением лица водой или натуживаясь на вдохе, то есть, выполняя пробы Вальсальвы. Если эти методы не помогают, необходимо вызвать скорую помощь.

Также при борьбе с приступами тахикардии, вызванными синдромом CLC, можно прибегнуть к услугам кардиолога, который должен назначить специальные медикаменты, например, «Верапамил» или «Амиодарон».

В случае когда приступы тахикардии сильно влияют на жизнь больного, проводится операция по разрушению пучков Джеймса, что предотвращает возникновение кругового хода возбуждения. Подобные операции не опасны, и после пациент быстро идёт на поправку.

Синдром CLC

Последнее обновление статьи: Апрель , 2019

Сокращение сердца происходит под воздействием электрического импульса, который распространяется в сердце по специальным проводникам – проводящим путям. Если кроме основных путей в сердце существуют и функционируют еще и дополнительные пути проведения, то электрокардиограмма претерпевает определенные изменения.

В одном случае происходят более грубые изменения кардиограммы (деформация желудочкового комплекса) — тогда речь идет о феномене или синдроме WPW, в другом случае – менее грубые (изменяется только скорость проведения между предсердиями и желудочками), — тогда это называется синдром CLC или синдром LGL (по сути, одно и то же).

Диагностировать данный синдром можно только при проведении ЭКГ, других специфических симптомов не существует.

Синдром CLC достаточно часто встречается у здоровых людей и в подавляющем большинстве не нарушает их образа жизни, поэтому его обладатели нередко даже не подозревают о наличии у них этой аномалии.

Тем не менее, не всегда дополнительные пути в сердце так безобидны. Дело в том, что наличие дополнительного пути всегда увеличивает шанс развития некоторых аритмий, при которых пульс может достигать более 180-200 ударов в минуту. И если у молодых такое состояние редко приводит к существенным последствиям, то у старшего поколения пациентов, с сопутствующей патологией сердца, такая аритмия всегда потенциально опасна.

Что делать, если у вас выявлен CLC синдром

Первым делом не нужно паниковать, особенно если кроме изменений на ЭКГ у вас нет, и никогда не было приступов сердцебиения с частотой более 180 ударов и потери сознания. Тем не менее, существует одно исследование, которое может с большой вероятностью предсказать даст ли о себе знать CLC в будущем или так и останется случайной находкой на ЭКГ. Называется это исследование ЧПЭКС – ЧреспПищеводная ЭлектроКардиоСтимуляция.

ЧПЭКС позволяет определить способность аномального пути проведения проводить импульс с большой частотой. Так если дополнительный путь не сможет провести импульсы с частотой, к примеру, более 100-120 в минуту, то волноваться по поводу него нечего. Если же при ЧСПЭК окажется, что пучок способен пропускать импульсы с частотой более 170-180 в минуту или еще хуже — в процессе обследования запуститься аритмия, то с большой вероятностью потребуется специализированное лечение.

Речь идет о хирургическом лечении – катетерной абляции, потому что медикаментозное лечение синдрома CLC, как и синдрома WPW, в 99,9% случаев оказывается неэффективным.

The following two tabs change content below.

Автор статьи, доктор Гохман Александр. врач- кардиолог/терапевт интернист медицинский центр Каплан (Израиль)

Синдром CLC Клерка-Леви-Кристеско — Кардиология — 18.03.2018

Отвечает Воробьев Антон Сергеевич

кардиолог, хирург-аритмолог

Добрый день! Сразу скажу, что я не занимаюсь вопросами военно-врачебной экспертизы. В Приложении к Положению о военно-врачебной экспертизы (Требования к состоянию здоровья граждан […]; Раздел 9. Болезни системы кровообращения) про Ваши изменения на ЭКГ написано следующее: неполная блокада правой ножки пучка Гиса, а также синдром Клерка-Леви-Кристеско, не сопровождающийся пароксизмальными нарушениями ритма сердца, не являются основанием для применения этой статьи и не препятствуют прохождению военной службы и поступлению в военно-учебные заведения. Ссылка на документ: http://base.garant.ru/70411156/861df654dc568c97b03a2aca18e68eac/#friends Соответственно, ограничений быть не должно. Кроме того, если вручную измерить искомый интервал (PQ) на Вашей ЭКГ, то он составляет около 120 мс, что соответствует нижней границе нормы. Даже если данный интервал на других ЭКГ менее 120 мс, то это не требует какого-либо лечения, поскольку является вариантом нормы. Соответственно интервал PQ никак не надо увеличивать. С уважением, Воробьев А.С.

анонимно

В МВД руководствуются Приказом МВД от 14 июля 2010 г. N 523, БОЛЕЗНИ СИСТЕМЫ КРОВООБРАЩЕНИЯ, статья 42, Ревматические и неревматические болезни сердца: а) с сердечной недостаточностью тяжелой и средней степени тяжести. К пункту «а» относятся:…стойкие, не поддающиеся лечению нарушения ритма сердца и проводимости (полная AV-блокада, AV-блокада II степени, блокада левой ножки пучка Гиса, трехпучковые блокады, политопная желудочковая экстрасистолия, синдром слабости синусового узла, синдром WPW и CLC). Скажите, пожалуйста, есть разница между феноменом CLC b синдромом CLC? Может у меня лишь феномен? Если у меня синдром, могу ли я вылечить его кардиоверсией или электрической абляцией? (очень хочу работать в МВД). Пожалуйста, дайте совет.

Воробьев Антон Сергеевич

Добрый вечер! Спасибо за указание на документ. Термин ‘синдром CLC’ используется там однократно и однозначно относится к пункту «а». Как это реализуется на практике я подсказать не могу, поэтому пишу о клинической составляющей. «Скажите, пожалуйста, есть разница между феноменом CLC b синдромом CLC? Может у меня лишь феномен?» Разница есть. Попробую объяснить. Электрические импульсы, которые заставляют сердце сокращаться возникают в правом предсердии, возбуждают оба предсердия и доходят до «проводка», соединяющего предсердия и желудочки. Этот «проводок» называется предсердно-желудочковый (АВ)-узел. При феномене CLC (на самом деле, этот термин в настоящее время не рекомендован к использованию из-за его неточности) возможны следующие варианты: 1. АВ-узел сравнительно быстро проводит электрические импульсы, что проявляется укорочением одного из интервалов (PQ) на ЭКГ. Этот вариант является абсолютной нормой. С ним ничего делать не надо. 2. Помимо АВ-узла имеются дополнительные «проводки», соединяющие предсердия и желудочки. В дополнительных «проводках» могут потенциально закручиваться электрические импульсы и вызывать приступы сердцебиения. Если возникают приступы сердцебиения, то мы можем говорить о синдроме CLC. Применительно к Вашей ситуации Выше я написал, что заключение о наличии феномена CLC некорректно, поскольку данные о величине интервала PQ (100 мс) получены на основании автоматического измерения. При ручном измерении получается 120 мс (нижняя граница нормы). Поскольку феномена CLC у Вас нет, то вопрос о наличии синдрома или феномена должен автоматически отпасть. Я бы рекомендовал попытаться получить направление на консультацию аритмолога, чтобы получить заключение об отсутствии данного синдрома. Возможно обсуждение чреспищеводного ЭФИ для окончательного исключения дополнительных предсердно-желудочковых соединений (сразу скажу, что если бы Вы были обычным пациентом, то это исследование я бы не рекомендовал и просто сказал, что ЭКГ соответствует норме). Ни абляция, ни электрокардиоверсия не применимы к Вашему случаю. С уважением, Воробьев А.С.

Феномены преждевременного возбуждения желудочков Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

013. ФЕНОМЕНЫ ПРЕЖДЕВРЕМЕННОГО ВОЗБУЖДЕНИЯ ЖЕЛУДОЧКОВ.

PHENOMENA PREEXCITATION

М.В. Потапова, О.Р. Соколова, МСЧ МВД по

РТ, Казань, Россия.

M.V. Potapova, O.R. Sokolova, Medikisanitamaya of MIA on the RT, Kazan, Russia.

Реферат. Синдром преждевременного возбуждения желудочков сердца — ускоренное проведение импульса возбуждения между предсердиями и желудочками сердца по дополнительным аномальным проводящим путям. В клинической практике наиболее часто встречаются 2 синдрома (феномена) предвозбуждения: Синдром

Вольффа-Паркинсона-Уайта (Wolff-Parkinson-White или WPW-синдром). Синдром Клерка-Леви-Кристеско (CLC-синдром), или синдром короткого интервала PQ. В англоязычной литературе этот синдром называют также синдромом LGL (Lown-Ganong-Levine).

Ключевые слова: Синдром преждевременного возбуждения желудочков, Вольффа-Паркинсона-Уайта, Клерка-Леви-Кристеско, дополнительные пути проведения.

Abstract. Preexcitation syndrome of heart — the accelerated implementation of the excitation pulse between the atria and ventricles of additional aberrant conductive pathways. In clinical practice, the most frequent two syndrome (phenomenon) predvozbuzhdeniya: Wolff-Parkinson-White syndrome

(Wolff-Parkinson-White or WPW-syndrome). Syndrome Klerk Levi Cristesco (CLC-syndrome), or the syndrome of a short interval PQ. In English literature, this syndrome is also called syndrome LGL (Lown-Ganong-Levine).

Keywords: preexcitation syndrome, Wolff-

Parkinson-White syndrome, Clerc-Levy-Cristesco, additional ways to condact.

Как известно, аритмический синдром часто является одним из первых клинических проявлений патологии сердечнососудистой системы в молодом возрасте. Согласно современным данным, в структуре функциональных заболеваний сердца у детей, подростков и лиц молодого возраста нарушения ритма сердца составляют 60,8%. В последнее десятилетие аритмиям, развивающимся на фоне

соединительнотканных дисплазий сердца, уделяют особое внимание, поскольку такие аномалии приводят к развитию клинически значимых патологических состояний и жизнеопасных, а порой и фатальных осложнений[1,4].

Многие аспекты, связанные с механизмом возникновения нарушений ритма и проводимости у людей молодого возраста с малыми аномалиями сердца, их течение и прогноз у конкретных больных, остаются малоизученными, а высказанные предположения на этот счет — спорными.

В связи с возросшими нагрузками экологического характера, улучшением возможностей современной диагностики количество больных с синдромом соединительнотканной дисплазии резко увеличилось. Преобладание среди них людей

молодого, а значит трудоспособного, призывного и детородного возраста придают данной проблеме не только медицинскую, но и социальную значимость[5].

Синдром преждевременного возбуждения желудочков сердца — ускоренное проведение импульса возбуждения между предсердиями и желудочками сердца по дополнительным аномальным проводящим путям, проявляющееся характерными изменениями ЭКГ и нередко также пароксизмами сердечных тахиаритмий. Синдромы предвозбуждения

желудочков представляют собой результат

врожденных нарушений в проводящей системе сердца, связанных с наличием дополнительных аномальных проводящих путей между миокардом предсердий и желудочков.

Синдромы предвозбуждения желудочков часто сопровождаются развитием пароксизмальных тахикардий[7,8].

В клинической практике наиболее часто встречаются 2 синдрома (феномена) предвозбуждения:

Синдром Вольффа-Паркинсона-Уайта (Wolff-Parkinson-White или WPW-синдром).

Синдром Клерка-Леви-Кристеско (CLC-синдром), или синдром короткого интервала PQ. В англоязычной литературе этот синдром называют также синдромом LGL (Lown-Ganong-Levine).

Эпидемиология синдромов предвозбуждения желудочков.

Распространённость синдрома WPW составляет по разным данным от 0.15 до 2%, синдром СЬС выявляется приблизительно у 0,5% взрослого населения[1,3,14].

Наличие дополнительных путей проведения обнаруживают у 30% пациентов с суправентрикулярной тахикардией.

Чаще синдромы предвозбуждения желудочков встречаются среди мужчин. Синдромы предвозбуждения желудочков могут проявляться в любом возрасте.

Этиология синдромов предвозбуждения желудочков.

Синдромы предвозбуждения желудочков обусловлены сохранением в результате незавершенной в эмбриогенезе перестройки сердца дополнительных путей проведения импульса.

Наличие дополнительных аномальных проводящих путей при синдроме WPW (пучки, или пути Кента) является наследственным нарушением. Описана связь синдрома с генетическим дефектом в

гене PRKAG2, расположенном на длинном плече 7 хромосомы в локусе q36. Среди кровных родственников больного распространенность аномалии повышена в 4-10 раз [6,9].

Синдром WPW нередко (до 30% случаев) сочетается с врожденными пороками сердца и другими сердечными аномалиями такими как аномалия Эбштейна (представляет смещение трикуспидального клапана в сторону правого желудочка с деформацией клапанов; генетический дефект при этом предположительно локализован на длинном плече 11 хромосомы), а также стигмами эмбриогенеза (синдром дисплазии соединительной ткани).С также является врожденной аномалией. Изолированное укорочение интервала PQ без пароксизмальных наджелудочковых тахикардий может развиваться при ИБС, гипертиреозе, активном ревматизме и носит доброкачественный характер.

Патогенез синдромов предвозбуждения желудочков.

Суть синдрома (феномена) преждевременного возбуждения желудочков состоит в аномальном распространении возбуждения от предсердий к желудочкам по так называемым дополнительным путям проведения, которые в большинстве случаев частично или полностью «шунтируют» АВ-узел[7,8,9].

В результате аномального распространения возбуждения часть миокарда желудочков или весь миокард начинают возбуждаться раньше, чем это наблюдается при обычном распространении возбуждения по АВ-узлу, пучку Гиса и его ветвям[1,2].

В настоящее время известны несколько дополнительных (аномальных) путей АВ-проведения:

— Пучки Кента, связывающие предсердия и миокард желудочков, в том числе скрытые ретроградные.

— Волокна Махейма, соединяющие АВ-узел с правой стороной межжелудочковой перегородки или разветвлениями правой ножки пучка Гиса, реже -ствол пучка Гиса с правым желудочком.

— Пучки Джеймса, соединяющие синусовый узел с нижней частью АВ-узла.

— Тракт Брешенманше, связывающий правое предсердие с общим стволом пучка Гиса.

— Дополнительные (аномальные) пути АВ-проведения.

Наличие дополнительных (аномальных) путей приводит к нарушению последовательности деполяризации желудочков. Образовавшись в синусовом узле и вызвав деполяризацию предсердий, импульсы возбуждения распространяются к желудочкам одновременно через предсердножелудочковый узел и добавочный проводящий путь. В связи с отсутствием физиологической задержки проведения, свойственной АВ-узлу, в волокнах добавочного пути распространившийся по ним импульс достигает желудочков раньше, чем тот, который проводится через АВ-узел. увеличиваются. Однако значительная часть миокарда желудочков охватывается возбуждением, которое успевает распространиться нормальным путем, по системе Гиса

— Пуркинье. В результате возбуждения желудочков из двух источников образуются сливные комплексы QRS. Начальная часть этих комплексов, так называемая дельта-волна, отражает преждевременное

возбуждение желудочков, источником которого служит добавочный проводящий путь, а его конечная часть обусловлена присоединением к их деполяризации импульсом, который проводится через предсердно-желудочковый узел. При этом уширение комплекса QRS нивелирует укорочение интервала PQ, так что их суммарная продолжительность не изменяется[9,12].

Выраженность преждевременного возбуждения и соответственно продолжительность дельта-волны и интервала PQ могут быть различными. Чем больше скорость проведения по добавочному пути и меньше -через предсердно-желудочковый узел, тем большая часть миокарда желудочков охватывается преждевременным возбуждением. У одного и того же больного она может колебаться в зависимости от ряда факторов, основным из которых является тонус симпатической и парасимпатической части вегетативной нервной системы, который оказывает существенное влияние на предсердно-желудочковую проводимость.

Функционирование межузлового тракта Джемса проявляется лишь ускорением предсердножелудочковой проводимости при неизмененном возбуждении желудочков, которое распространяется по системе Гиса — Пуркинье, что проявляется укорочением интервала РО при отсутствии дельтаволны и аберрантности комплекса QRS (синдром СЬС). Обратная картина наблюдается при функционировании добавочного

фасцикуловентрикулярного тракта Махейма в дистальных отделах систем Гиса-Пуркинье. Преждевременное возбуждение небольшой части миокарда одного из желудочков обусловливает

образование на ЭКГ нечетко выраженной дельтаволны и умеренного уширения комплекса QRS (около

0,12 с) при неизмененном времени предсердножелудочкового проведения. Такой вариант преждевременного возбуждения желудочков иногда называют атипичным вариантом синдрома Вольффа-Паркинсона-Уайта[13].

Однако основное клиническое значение дополнительных путей проведения состоит в том, что они нередко включаются в петлю кругового движения волны возбуждения (re-entry) и способствуют, таким образом, возникновению наджелудочковых

пароксизмальных тахикардий.

В настоящее время предлагается преждевременное возбуждение желудочков, не

сопровождающееся возникновением пароксизмальной тахикардии, называть “феноменом предвозбуждения”, а случаи, когда имеются не только ЭКГ-признаки предвозбуждения, но и развиваются пароксизмы наджелудочковой тахикардии — “синдромом

предвозбуждения”, однако ряд авторов не согласны с таким разделением.

Клиника и осложнения.

Клинически синдромы предвозбуждения

желудочков не имеют специфических проявлений и сами по себе не оказывают влияния на гемодинамику.

Клинические проявления синдромов

предвозбуждения могут наблюдаться в различном возрасте, спонтанно или после какого-либо заболевания; до этого момента пациент может быть асимптоматичен.

Синдром Вольффа-Паркинсона-Уайта часто сопровождается различными нарушениями сердечного ритма:

Примерно у 75% больных синдром WPW сопровождается пароксизмальными тахиаритмиями

[7,8,11].

В 80% случаев при синдроме WPW возникают реципрокные наджелудочковые тахикардии (с возрастом могут перерождаться в мерцательную

аритмию).

В 15-30% случаев синдрома Вольффа-Паркинсона-Уайта развивается фибрилляция, в 5% случаев — трепетание предсердий, причем характерна высокая частота мерцания или трепетания (до 280-320 ударов в минуту, при трепетании с проведением 1:1) с соответствующей выраженной симптоматикой (ощущение сердцебиения, головокружение, обмороки, одышка, боли в грудной клетке, гипотензия или другие гемодинамические нарушения) и

непосредственной угрозой перехода в фибрилляцию желудочков и смерти.

При WPW-синдроме также возможно развитие менее специфичных аритмий — предсердной и желудочковой экстрасистолии, желудочковых тахикардий [3,5,11].

У больных с синдромом CLC также имеется повышенная склонность к возникновению пароксизмальных тахикардий[3,14].

Осложнения синдромов предвозбуждения желудочков.

Тахиаритмия.

Внезапная сердечная смерть.

К факторам риска внезапной смерти при WPW-синдроме относят:

1. Длительность минимального интервала RR при мерцательной аритмии менее 250 мс.

2.Длительность эффективного рефрактерного периода дополнительных путей менее 270 мс.

3.Левосторонние дополнительные пути или несколько дополнительных путей.

4. Наличие симптоматичной тахикардии в анамнезе.

5.Наличие аномалии Эбштейна.

6.Семейный характер синдрома.

7.Рецидивирующее течение синдромов предвозбуждения желудочков.

Методы диагностики синдромов

предвозбуждения желудочков.

1. ЭКГ-признаки синдрома WPW.

2. ЭКГ триада синдрома WPW.

3. Укорочение интервала PQ(R) (менее 120 мс).

4. Наличие дополнительной 5(дельта)-волны на восходящем колене комплекса QRS, которая отражает ускоренное проведение импульса от предсердий к желудочку по дополнительным путям. Для определения локализации дополнительных путей оцениваются полярность дельта-волны в различных отведениях, а также полярность комплекса QRS в отведениях V1-V3, что имеет значение при подготовке к хирургическому лечению. Соответственно выделяют морфологические типы WPW-синдрома (типы А, В, С, атипичные варианты).

5. Широкий (сливной, деформированный) комплекс QRS (более 120 мс). Возможны вторичные изменения сегмента ST и зубца Т (дискордантность).

6. Данная триада не всегда наблюдается в полном виде. Возможно временное исчезновение волны предвозбуждения в результате изменений вегетативного статуса, брадикардии, физической нагрузки и других причин (преходящая форма синдрома).

7. Перемежающийся (интермиттирующий) WPW-синдром определяется чередованием на одной и той же ЭКГ комплексов, характерных для синдрома, с обычными синусовыми циклами.

8. Развитие блокады ножки на стороне

локализации дополнительного пути маскирует дельтаволну. Дискордантность конечной части

желудочкового комплекса при синдроме WPW могут имитировать проявления ИБС.

Рисунок 1

ЭКГ при синдроме WPW

ЭКГ признаки синдрома СЬС.

1.Укорочение интервала Р0(Ю,

продолжительность которого не превышает 0,11 с.

2. Отсутствие в составе комплекса QRS дополнительной волны возбуждения — дельта-волны.

3. Наличие неизмененных (узких) и

недеформированных комплексов QRS (за

исключением случаев сопутствующей блокады ножек и ветвей пучка Гиса).

Рисунок 2

ЭКГ при синдроме CLC.

Дифференциальная диагностика синдромов преждевременного возбуждения желудочков.

Дифференциальную диагностику манифестного синдрома преждевременного возбуждения желудочков при синусовом ритме проводят с блокадами ножек пучка Гиса со сходной графикой комплекса QRS. При этом важное значение имеет поиск дельта-волны путем тщательного анализа ЭКГ во всех 12 отведениях.

ЭКГ-признаки наиболее актуальных аритмий при синдромах предвозбуждения:

1. Электрокардиографические признаки

наджелудочковой тахикардии типа ри-энтри с участием добавочных проводящих путей при синдроме преждевременного возбуждения

желудочков:

2. Правильный ритм сердца с частотой в пределах 140-240 (250) ударов в 1 минуту.

3. Комплексы QRS чаще не изменены либо (реже) уширены, в ряде случаев с наличием в начальной части дельта-волны.

4. При наличии аритмии с широким комплексом QRS ее необходимо дифференцировать от наджелудочковой тахикардии с преходящей блокадой

ножки пучка Гиса и желудочковой тахикардии. Для этого необходима оценка ранее снятых ЭКГ (наличие синдрома предвозбуждения).

5. В сомнительных случаях тахикардии с широким комплексом следует расценивать как желудочковые.

6. Зубцы Р следуют за комплексами ORS. Их полярность может быть разной в зависимости от локализации добавочного пути.

7. Особенности ЭКГ при мерцательной аритмии у

больных с преждевременным возбуждением

желудочков:

8. Выраженная тахикардия. ЧСС обычно более 180-200 ударов в 1 минуту.

9. Комплексы QRS часто широкие, с признаками

преждевременного возбуждения желудочков (дельтаволной). Широкие комплексы QRS могут

чередоваться с узкими и сливными.

Инструментальные методы обследования.

ЭКГ мониторирование по Холтеру применяется для выявления периодически возникающих

нарушений ритма.

Эхокардиогрфия необходима для выявления сопутствующих кардиомиопатий, пороков сердца и признаков аномалии Эбштейна.

Пробы с физической нагрузкой — велоэргометрия или тредмил тест. Использование данных методик в диагностике синдромов предвозбуждения ограничено, так как наличие пароксизмальных тахикардий в анамнезе является относительным противопоказанием к проведению нагрузочных проб, что особенно актуально при синдромах предвозбуждения, когда тахикардии особенно опасны.

Синдромы CLC и WPW часто являются причиной ложноположительных результатов при проведении нагрузочных проб.

Чреспищеводное стимулирование сердца (ЧПСС), проведенное при явном синдроме WPW позволяет доказать, а при скрытом — предположить наличие дополнительных путей проведения (характерен рефрактерный период менее 100 мс), индуцировать наджелудочковые пароксизмальные тахикардии, мерцание и трепетание предсердий. Чреспищеводное стимулирование сердца не позволяет провести точную топическую диагностику дополнительных путей, оценить характер ретроградного проведения, выявить множественные дополнительные пути.

Прогноз. У пациентов с признаками преждевременного возбуждения желудочков при отсутствии жалоб прогноз хороший, так как вероятность возникновения быстрого проведения импульсов через добавочный путь мала. По мнению большинства специалистов, такие больные не нуждаются в наблюдении. Важно помнить, что приблизительно у 80% пациентов с WPW возникают пароксизмы реципрокной тахикардии, у 15-30% -фибрилляции предсердий и у 5% наблюдают трепетание предсердий. Вентрикулярная тахикардия

развивается довольно редко. Пациенты с синдромом WPW имеют небольшой риск возникновения внезапной сердечной смерти (в 0,1% случаев).

Цель нашего исследования — изучить частоту встречаемости синдрома Клерка-Леви-Кристемко и синдрома Вольффа-Паркинсона-Уайта среди поступающих на службу в органы МВД по РТ в возрасте от 18 до 26 лет и выявление сопутствующей патологии.

Материалы и методы.

Настоящая работа основана на результатах клинико-инструментального и лабораторного обследования 500 человек вновь поступающих на службу в органы МВД (450 лиц мужского пола и 50 лиц женского пола) в возрасте от 18 до 26 лет, проживающих в г. Казани и различных районах Республики Татарстан. Средний возраст пациентов составил 23,5 ± 2,5 лет.

Всем поступающим на службу в органы МВД проводилось комплексное обследование, включающее общеклинические методы, физикальное исследование, оценка исходного вегетативного статуса,

выраженности вегетативных нарушений, осмотры невролога, эндокринолога, офтальмолога, ЛОР-врача, хирурга. Функциональные методы исследования -стандартная электрокардиография покоя с регистрацией 12 отведений, проба с физической нагрузкой (тест Мастера, приседания), допплер-эхокардиография, непрерывное суточное

мониторирование ЭКГ по Холтеру с оценкой вариабельности сердечного ритма.

При проведении эхоэлекторокардиографического обследования изучались следующие показатели: диаметр аорты, открытие створок аортального клапана, диаметр левого предсердия в диастолу, толщина передней стенки правого желудочка, диаметр правого желудочка в диастолу, толщина межжелудочковой перегородки в диастолу и систолу, конечный диастолический и конечный систолический размеры левого желудочка, толщина задней стенки левого желудочка в диастолу и систолу. Оценивались следующие функции миокарда: фракция укорочения (сокращения) левого желудочка, фракция выброса, конечный диастолический объем, конечный систолический объем, ударный объем, минутный объем. Оценивался характер движения створок митрального, трикуспидального и аортального клапанов.

Топическая диагностика и степень выраженности аритмического синдрома проводилась с использованием общепринятых методов

электрокардиографии и непрерывного суточного мониторирования ЭКГ по Холтеру. Из функциональных проб использовалась проба с физической нагрузкой для выявления скрытых нарушений процессов реполяризации. Проводился анализ следующих параметров ЭКГ: ЧСС, оценка интервалов PQ, QТ, изменения комплекса QRS и процессов реполяризации (комплекса ST — Т).

Признак I группа (п=450) II группа (п=50)

% %

СЬС СЬС WPW

Астенический тип конституции 11,3 7,1 28 28

Синдром гипермобильности суставов 5,3 4,8 12 6

Деформация грудной клетки 3,7 3,1 0 0

Сколиоз 22,6 18,4 14 4

Плоскостопие 7,5 6,6 2 0

Офтальмологические (миопия и др. аномалии рефракции) 3,7 2,6 10 4

Гиперэластичность кожи 0,6 0,4 0 0

Атрофические стрии 0,6 0,6 4 2

Арахнодактилия 0,2 0 0 0

Результаты. Обсуждения. При анализе выраженности фенотипических проявлений мы

включили астеническую конституцию, костноскелетные аномалии, такие как сколиоз (без оговорки

о степени его выраженности), деформации грудной клетки (воронкообразная или килевидная, без учета требований о хирургической коррекции), признаки синдрома гипермобильности суставов,

арахнодактилию, плоскостопие (без учета типа и степени), офтальмологические проявления дисплазии (миопия и другие аномалии рефракции),

гиперэластичность кожи, атрофические стрии без признаков эндокринологической патологии. Наличие астенического телосложения подтверждалось преобладанием продольных размеров тела и относительным удлинением верхних конечностей

(показатель размах рук/рост > 1,03). Для оценки повышенной растяжимости кожи мы использовали тест — величина кожной складки над наружными концами ключиц безболезненно оттягивается на 3 см и более.

При сравнительном анализе распространенности внешних фенотипических признаков в нашем исследовании наиболее низкой специфичностью обладали — наличие астенической конституции, сколиоза, гипермобильность суставов, которые встречались с наибольшей частотой в обеих группах пациентов и не было достоверных различий между частотой встречаемости данных признаков. Наибольшее диагностическое значение имели изменения со стороны кожи (атрофические стрии), плоскостопие, которые достоверно чаще отмечались у вновь поступающих мужского пола а также гиперэластичность кожи, деформации грудной клетки, которые выявлялись только лиц мужского пола (Таблица 1).

Таблица 1

Таблица 2

Анатомические особенности у вновь поступающих в органы МВД по РТ с Синдромом Клерка-Леви-Кристеско и Вольффа-Паркинсона-Уайта в возрасте 18-26 лет.

При сравнительном анализе в нашем исследовании СЬС и WPW синдромов выявлено, что в

I и II группе обследуемых чаще встречается СЬС синдром (Таблица 2). По результатам проведенного нами исследования следует, что имеет место существование некоторой зависимости наличия выше указанных видов нарушения ритма от конституциональных особенностей пациентов. У лиц с астеническим типом конституции 11,3% случаев СЬС синдрома в первой группе и 28% во II группе. Наиболее выраженной оказалась взаимосвязь нарушений ритма с наличием сколиоза, так в I группе 22,6% СЬС синдром, WPW 18,8%, во II группе 14% СДС и 4% WPW синдром.

Таким образом, помимо наличия аномальных путей проведения в миокарде, имеют место сопутствующие заболевания, синдромы, указывающие на системный характер патологического процесса.

У пациентов с признаками преждевременного возбуждения желудочков при отсутствии жалоб прогноз хороший, так как вероятность возникновения быстрого проведения импульсов через добавочный путь мала. СЬС синдром носит доброкачественный характер и при отсутствии нарушений ритма не препятствует поступлению на службу, несению службы и поступлению в образовательные учреждения МВД.

Данную категорию пациентов следует включить в группу риска по вероятному возникновению нарушения ритма и проводимости, так же как пациенты с отягощенным семейным анамнезом в отношении внезапной смерти, а также имеющие социальные показания, например профессиональные спортсмены или летчики.

Важно помнить, что приблизительно у 80% пациентов с WPW возникают пароксизмы реципрокной тахикардию, у 15-30% — фибрилляции предсердий и у 5% наблюдают трепетание предсердий. Вентрикулярная тахикардия развивается довольно редко. Пациенты с синдромом WPW имеют небольшой риск возникновения внезапной сердечной

Внешние признаки I группа (п=450) II группа (п=50)

% %

Астенический тип конституции 18,4 56

Синдром гипермобильности суставов 10,2 18

Деформация грудной клетки 6,8 0

Сколиоз 41,1 26

Плоскостопие 14,2 4

Офтальмологические (миопия и др. аномалии рефракции) 6,4 14

Гиперэластичность кожи 1,1 0

Заболевания эндокринной системы 1,3 6

Арахнодактилия 0,2 0

смерти (в 0,1% случаев). В связи с выше изложенными осложнениями, лица с синдромом Вольффа-Паркинсона-Уайта признаются не годными для поступления на службу в органы МВД, так как напряженный труд сотрудника МВД требует серьезной физической подготовки. И при возникновении экстремальной ситуации он должен принять правильное решение, требующее от него полной физической и психологической отдачи, от которого зависит безопасность и жизнь окружающих людей.

На современном этапе развития медицины, своевременная диагностика и создание условий для максимальной компенсации проявлений, будет способствовать профилактике развития вторичных осложнений и улучшение качества жизни людей.

Литература:

1. Бабкина А.В. Синдром ранней реполяризации желудочков у детей с малыми аномалиями сердца / А. В. Бабкина // Материалы 2 Международной научной конференции молодых ученых ученых-медиков. -Курск, 2008. — Т.3. — С. 18 — 20.

2. Блинникова О.Е., Румянцева В.А. Гипермобильность суставов в детском возрасте. Педиатрия 2001; 1: 68-77.29.

3. Де Луна А. Б. Руководство по клинической ЭКГ. Пер. с англ. М 1993.34. Кисляк О.А., Сторожаков Г.И., Явлюхин А.А., Чиковани Г.Ш. Врачебная тактика при синдроме укороченного интервала P-Q у подростков. Педиатрия 1998;

4. Домницкая Т. М. Прижизненная диагностика и клиническое значение аномально расположенных хорд сердца у взрослых и детей. Дис. канд. мед. наук. М 1990.

5. Дупляков Д. В., Емельяненко В. М. Синдром Вольфа-Паркинсона-Уайта у лиц с синдромом ранней реполяризации желудочков. Кардиология 1998; 3: 4648.44.

6.Земцовский Э.В. Соединительнотканные дисплазии сердца. Ст-Петербург: ТОО Политекс-Норд-Вест 2000.22.

7. Корженков А.А., Рябиков А.Н., Малютина С.К. Распространенность добавочных хорд в левом желудочке и СРРЖ 11 Кардиология.- 1991.-№ 4.-С.75.

8. Меньшикова Л.И., Сурова О.В., Макарова В.И. Дисплазии соединительной ткани сердца в генезе кардиоваскулярной патологии у детей. Электронная почта 2002.20.

9.Палеев Н.Р. Синдром укороченного интервала PQ при различных нарушениях ритма. Кардиология 1999.-№7 С.26-28.

10.Сумароков А.В., Домницкая Т.М., Овчаренко К. И. и др. Аномально расположенные хорды в комплексе проявлений малых аномалий соединительной ткани. Тер архив 1989.- №10 — С.143-145.

11. Юренев А.П. Деверэ Р. Об аномальных хордах сердца. Тер архив 1995.-№ 8 С. 23-24.

12. Basso C., Thiene G., Corrado D. Et al. Juvenile sudden death by cardiovascular disease. Eur Heart J. 1993.- 14.-P/165.

13. Rosenbaum M., Blanko H., Elizari M. Electrotonic modulation of the T wave and cardiac memory. Am J Cardiol 1982; 50: 213-232.39.

14. Hollister D.W., Godfrey M., Sakai L.Y.//N. Engl. J. Med. — 1990. — Vol.323.- P. 152- 159.

014. ОСОБЕННОСТИ КЛИНИКИ И

ФАРМАКОТЕРАПИИ ХРОНИЧЕСКОГО ПАНКРЕАТИТА У ЛИЦ ПОЖИЛОГО ВОЗРАСТА

Ю.Ф. Прохорова, Е.Ф. Садыкова, Л.Р. Абсалямова, И.А.Гималетдинова,С.Р .Абдулхаков,

Клинический госпиталь МСЧ МВД по республике Татарстан, Казань,

Кафедра общей врачебной практики КГМУ, Казань

Реферат. Хронический панкреатит — заболевание, распространенность которого за последние 30 лет неуклонно растет, в том числе среди пожилых. Физиологические возрастные изменения неизменно отражаются на течении хронического панкреатита, видоизменяя клиническую картину и подходы к лечению заболевания у пациентов пожилого возраста. В статье рассматриваются основные этиологические факторы, механизмы развития, варианты клинического течения и основные подходы к медикаментозной терапии хронического панкреатита у лиц старшей возрастной группы.

Ключевые слова: хронический панкреатит,

старение, пожилые, клиническая картина, лечение.

Abstract. Chronic pancreatitis — it is disease, prevalence of which has been steadly increasing during the last 30 years among the elderly people. Physiological, age-specific changes invariably influence the course of chronic pancreatitis, modifying clinical characteristics and treatment approaches to this disease in elderly people. Main etiological factors, developing mechanisms, clinical course options and basic approaches to medical therapy of chronic pancreatitis in elderly patients are described in the article.

Key words: chronic pancreatitis, ageing, elderly, clinical picture, treatment.

Хронический панкреатит — хроническое воспалительно-дистрофическое заболевание

поджелудочной железы, вызывающее при

прогрессировании патологического процесса нарушение проходимости ее протоков, склероз паренхимы и нарушение экзо- и эндокринной функций.

Распространенность и этиологические факторы

Достоверных данных о распространенности хронического панкреатита у пожилых нет. В общей структуре заболеваемости поджелудочной железы у лиц старше 60 лет хронический панкреатит регистрируется в 25% случаев [13].

Функция и дисфункция каналов CLC в норме и при патологии

Abstract

Каналы CLC и транспортеры экспрессируются в большинстве тканей и выполняют разнообразные функции. Существует четыре канала CLC человека, ClC-1, ClC-2, ClC-Ka и ClC-Kb, и пять транспортеров CLC, от ClC-3 до -7. Некоторые из каналов CLC дополнительно связаны с дополнительными субъединицами. В то время как barttin является обязательным для функциональной экспрессии ClC-K, GlialCam является факультативной субъединицей ClC-2, которая модифицирует гейтирование и, таким образом, увеличивает функциональную вариабельность внутри семейства CLC.Специфичные для изоформ ионная проводимость и свойства ворот оптимизируют отдельные каналы CLC для их клеточных задач. ClC-1 предпочтительно проводит при отрицательном напряжении, и получающееся в результате выпрямление внутрь обеспечивает большую проводимость хлорида в состоянии покоя без вмешательства в потенциал действия мышцы. Эксклюзивное открытие при напряжениях, отрицательных по отношению к потенциалу реверсии хлоридов, позволяет ClC-2 регулировать внутриклеточные концентрации хлоридов. ClC-Ka и ClC-Kb в равной степени подходят для входящих и исходящих токов для поддержки трансцеллюлярных потоков хлоридов.Каждый ген канала CLC человека был связан с генетическим заболеванием, и изучение этих мутаций предоставило много информации о физиологических ролях и молекулярных основах функции канала CLC. Мутации в гене, кодирующем ClC-1, вызывают врожденную миотонию, заболевание, характеризующееся повышенной возбудимостью сарколеммы и ригидностью мышц. Потеря функции каналов ClC-Kb/барттина ухудшает резорбцию NaCl в колене Генле и вызывает гипонатриемию, гиповолемию и гипотензию у пациентов, страдающих синдромом Барттера.Мутации CLCN2 были обнаружены у пациентов с расстройствами ЦНС, но функциональная роль этой изоформы до сих пор не выяснена. Недавние связи между ClC-1 и эпилепсией и ClC-Ka и сердечной недостаточностью предполагают новые клеточные функции этих белков. Этот обзор направлен на обзор знаний о физиологических и патофизиологических функциях каналов CLC человека в свете недавних открытий биофизических, физиологических и генетических исследований.

Ключевые слова:

Ключевые слова: канал CLC, анионный канал, патч-кламп, врожденная миотония, синдром Барттера, лейкенцефалопатия(1990) установили семейство CLC белков-транспортеров анионов (рис. 1). Семейство CLC включает девять белков CLC человека, от ClC-1 до -7, а также белки ClC-Ka и -Kb. Одноканальные записи на ClC-0 выявили унитарную проводимость около 10 пСм (Miller, 1982), и, поскольку это значение предсказывает скорость транспорта, намного превышающую максимальные скорости переносчиков и насосов, почти не оставалось сомнений в том, что этот белок опосредует диффузию анионов через мембрану. водные проводящие пути. Унитарные амплитуды тока ClC-1 и ClC-2 подтверждают эту идею (Pusch et al., 1994; Weinreich, Jentsch, 2001), так что изначально предполагалось, что все члены семейства представляют собой анионные каналы. Таким образом, стало неожиданностью, когда было показано, что бактериальный гомолог E. coli функционирует как сопряженный анион/протонный обменник (Accardi and Miller, 2004). Последовательный анализ транспортных механизмов изоформ CLC человека показал, что пять из девяти CLC человека, от ClC-3 до ClC-7, представляют собой анион-протонные обменники, а не анионные каналы (Picollo and Pusch, 2005; Scheel et al., 2005; Neagoe и др., 2010; Лейл и др., 2011; Гусман и др., 2013). Таким образом, семейство CLC объединяет две функциональные группы с термодинамически разными транспортными процессами. Все экспериментальные данные, представленные до сих пор, подтверждают близкое структурное сходство членов семейства CLC и демонстрируют, что транспортные белки схожей структуры могут специализироваться в ионных каналах или транспортерах.

Семейство транспортных белков CLC включает хлоридные каналы и обменники хлорид/протон.(A) Филограмма демонстрирует раннее разделение белков CLC человека на одну ветвь хлоридных каналов, охватывающую ClC-1, ClC-2, ClC-Ka и ClC-Kb. Антипортеры хлорида / протона включают ClC-3 до -7. Каналам ClC-K требуется субъединица barttin, в то время как ClC-7 зависит от присутствия Ostm1 для нормального функционирования. Недавно GlialCAM был идентифицирован как дополнительная субъединица ClC-2. (B) Вид димера cmClC [идентификатор PDB: 3ORG (Feng et al., 2010)] в виде ленты.Одна субъединица показана светло-серым, а другая субъединица показана цветом от начала B-спирали синим до карбоксиконца красным. Верхняя часть белка включает трансмембранное ядро, а нижняя красная часть содержит карбоксиконцы с доменами CBS. (C) Более близкий вид некоторых критических остатков, координирующих ионы хлорида в ecClC (идентификатор PDB: 1OTS). Остатки Y445 и S107, окрашенные в пурпурный цвет, отвечают за связывание хлорида (зеленая сфера) в S cen , а также предполагается, что они имеют решающее значение для медленного открытия каналов CLC.E148 представляет собой так называемый «запирающий глутамат», колеблющийся от S cen до S ext , и считается, что он активно участвует в быстром включении протопор каналов CLC.

CLC-каналы и транспортеры выполняют различные физиологические задачи. В то время как CLC-обменники в основном экспрессируются во внутриклеточных компартментах, таких как эндосомы или лизосомы, и, по-видимому, вносят вклад в регуляцию «домашнего хозяйства» этих органелл, CLC-каналы расположены в поверхностной мембране возбудимых и эпителиальных клеток и способствуют регуляции возбудимости мембраны, а также транспорт электролитов, воды и питательных веществ.В этом обзоре мы сосредоточимся исключительно на канальной ветви семейства CLC, резюмируя их функции, их клеточные роли и возможное участие в заболеваниях.

Молекулярная физиология каналов CLC

Структурные детерминанты функции канала CLC

До сих пор не сообщалось о трехмерной структуре высокого разрешения для канала CLC. Однако анион/протонные обменники CLC были кристаллизованы из нескольких прокариотических и эукариотических видов (Dutzler et al., 2002; Аккарди и др., 2006 г.; Лобет и Дутцлер, 2006 г.; Фэн и др., 2010; Робертсон и др., 2010 г.; Джаярам и др., 2011 г.; Лим и др., 2012). Поскольку структурные свойства транспортеров CLC хорошо передаются для исследований структурно-функциональных функций, выполненных на каналах CLC (Miller, 2003), обычно предполагается, что каналы CLC структурно очень похожи на транспортеры CLC.

Все белки CLC собраны в виде димеров, причем каждая субъединица имеет 18 трансмембранных спиралей (обозначенных от A до R), за которыми следует цитозольный карбоксиконец, содержащий два консервативных домена цистатионин-ß-синтазы (CBS) в эукариотических CLC (Bateman, 1997). ) (Фигура ).Каждая субъединица связывает анионы без участия других субъединиц — в полном согласии с двумя отдельными активными центрами, которые транспортируют анионы независимо в двух соседних субъединицах. Эта своеобразная архитектура уже была предложена на основе ранних одноканальных записей, которые демонстрировали два равноотстоящих состояния проводимости и предполагали существование двух путей ионной проводимости, так называемых протопор, для каждого отдельного канала CLC (Miller, 1982; Miller and White, 1984). ). Три отдельных сайта связывания хлоридов внутри каждой субъединицы были идентифицированы в трехмерных структурах, S int , S cen и S ext , названных в честь их положения относительно вне- или внутриклеточной стороны плазмы. мембрана.Центральное положение образует значительную часть фильтра селективности с консервативными аминокислотами S107, I109, F357 и Y445 в дополнение к менее консервативным F348 и I356 (рисунок; все положения даны для EcClC), которые координируют ион хлорида в пределах проводимости. пути (Dutzler et al., 2002, 2003; Lobet and Dutzler, 2006). Отсутствуют полные положительные заряды, например, от боковых цепей аргинина или лизина, участвующих в формировании сайтов связывания анионов, что согласуется с представлением о том, что белки CLC используют спиральные дипольные моменты для создания положительного электростатического потенциала, необходимого для анионной селективности (Dutzler et al., 2002; Гуо и Маккиннон, 2005).

Отдельные структуры переносчиков CLC демонстрируют сходную складку остова, но, по-видимому, представляют разные конформации цикла обмена Cl /H + . Сравнение этих конформаций показывает движение консервативной боковой цепи глутамата, E148 в EcClC (рис. ), изнутри наружу пути проведения, переключающегося с S cen на S ext . Такие движения зависят от статуса протонирования и, вероятно, объясняют перенос протонов в стехиометрии от 2 Cl до 1 H + (Dutzler et al., 2003; Аккарди и Миллер, 2004 г.; Фэн и др., 2010; Пиколло и др., 2012).

Известно, что два карбоксиконцевых домена CBS эукариотических каналов CLC взаимодействуют и образуют внутримолекулярные димерные комплексы. Частичное удаление доменов CBS может вызвать либо потерю функции, либо изменения в закрытии каналов или внутриклеточном распределении (Maduke et al., 1998; Estévez et al., 2004; Hebeisen et al., 2004; Hebeisen and Fahlke, 2005; Гарсия-Оливарес и др., 2008). Недавняя структура эукариотического транспортера CLC предполагает взаимодействие между доменами CBS и внутриклеточными полюсами спиралей D и R.Поскольку эти спирали содержат боковые цепи серина и тирозина, координирующие S cen (S107 и Y445 в EcClC), это взаимодействие обеспечивает структурную основу для регуляции функции CLC с помощью кларбоксиль-концевых доменов (Hebeisen and Fahlke, 2005; Feng et al. , 2010). Дополнительные межсубъединичные взаимодействия димеров CBS наблюдались in vitro для изолированных карбокси-концов ClC-5 и ClC-Kb (Meyer et al., 2007; Martinez and Maduke, 2008). Такие взаимодействия могут играть роль в межсубъединичной коммуникации и могут способствовать кооперативным гейт-процессам (Быкова и др., 2006).

Функциональные свойства каналов CLC в экспериментах по фиксации напряжения

Гетерологическая экспрессия каналов CLC в ооцитах Xenopus и клетках млекопитающих позволила провести детальный функциональный анализ всех каналов CLC человека. На рисунке показаны записи пэтч-клэмп цельных клеток из клеток HEK293, сверхэкспрессирующих каналы CLC человека, и иллюстрируется функциональное разнообразие этих различных белков. Для всех записей клетки подвергались почти симметричному распределению хлорида поперек плазматической мембраны, держались на уровне 0 мВ, и применялись скачки напряжения в широком диапазоне.

Записи пэтч-клэмп цельных клеток демонстрируют функциональную изменчивость каналов CLC человека. (A-D) Репрезентативные токовые ответы клеток HEK293T, экспрессирующих ClC-1, ClC-2, ClC-Ka/barttin или ClC-Kb/barttin, на указанные протоколы напряжения (левый столбец). В правом столбце показаны зависимости от напряжения вероятностей открытия быстрых протопор (темные кружки) и медленных общих ворот (светлые кружки), а также вероятности того, что канал будет проводящим (жирная линия).Запись ClC-1 воспроизведена из Weinberger et al. (2012), в то время как записи ClC-Ka и -Kb были воспроизведены из Riazuddin et al. (2009).

В то время как амплитуды тока ClC-Ka/barttin и ClC-Kb/barttin почти не зависят от времени, скачки напряжения приводят к зависимой от времени и напряжения релаксации амплитуды тока ClC-1 и ClC-2, которую можно использовать для кинетический анализ ворот канала. Изменения макроскопической амплитуды тока обычно следуют сумме двух экспоненциальных функций с отдельными временными константами.Две константы времени активации и деактивации обусловлены существованием двух воротных механизмов, которые либо действуют на отдельные протопоры, либо совместно на оба протопора (Miller, 1982). Во всех CLC-каналах млекопитающих открытие протопор примерно в 10 раз быстрее, чем обычное открытие (Miller, 1982; Saviane et al., 1999; Fischer et al., 2010; Stölting et al., 2013), что привело к синонимическому использованию термины быстрые/протопоровые ворота и медленные/общие ворота. Для многих каналов эти кинетические различия использовались для разделения двух процессов при записи макроскопических токов.Мгновенная амплитуда тока в хвостовом импульсе фиксированного напряжения переводится в относительную вероятность открытого канала в конце предшествующего испытательного напряжения (Hodgkin and Huxley, 1952). Вставка короткого тестового импульса в напряжение, при котором два процесса стробирования достаточно различаются по скорости, только манипулирует быстрым стробом и, таким образом, эффективно фиксирует его с одинаковой вероятностью открытия для всех предыдущих шагов напряжения. Такой подход позволяет измерять зависимость медленного стробирования от напряжения изолированно.Если предположить, что процессы быстрой и медленной селекции независимы, вероятность открытия быстрых ворот может быть рассчитана как отношение общей вероятности открытия канала к проценту открытых медленных ворот (Accardi and Pusch, 2000).

Хлоридный канал ClC-1 скелетных мышц (рис. ) открыт при 0 мВ, с быстрыми и медленными воротами, которые оба активируются деполяризацией мембраны (Accardi and Pusch, 2000). График зависимости амплитуды тока от мембранного потенциала показывает проводимость внутреннего выпрямления (Fahlke et al., 1995). Повсеместно экспрессируемый ClC-2 закрывается при положительном потенциале и активируется в течение очень медленного времени при гиперполяризации мембраны (рис. 1) (De Santiago et al., 2005). Запуск ClC-2 снова характеризуется двумя кинетически различными процессами ворот, которые оба активируются гиперполяризацией, а не деполяризацией, как в ClC-1. Как ClC-1, так и ClC-2 демонстрируют сильно выпрямляющие макроскопические амплитуды тока внутрь, но с другой механистической основой. Выпрямление каналов ClC-1 внутрь происходит из-за зависящей от напряжения унитарной проводимости, которая уменьшается при положительном напряжении примерно до 10% от проводимости при отрицательном потенциале (Pusch et al., 1994; Фальке и др., 1995; Рычков и др., 1998; Штёльтинг и др., 2014). Напротив, унитарные проводимости тока ClC-2 не зависят от напряжения, а выпрямление токов ClC-2 происходит из-за зависящего от напряжения стробирования, которое закрывает быстрый затвор при положительном напряжении до 0 мВ (Stölting et al., 2013).

ClC-Ka (рис. ) и ClC-Kb (рис. ) могут функционально экспрессироваться только вместе с дополнительной субъединицей барттина (Estévez et al., 2001; Waldegger et al., 2002; Scholl et al., 2006; Fischer et al. др., 2010). В клетках млекопитающих токи ClC-Kb/барттина не зависят от времени с небольшим двунаправленным выпрямлением. Напротив, каналы ClC-Ka/barttin очень быстро закрываются при переходе к отрицательному напряжению до -100 мВ. Эти очень быстрые процессы, вероятно, соответствуют быстрому закрытию протопор в этих каналах (Riazuddin et al., 2009; Fischer et al., 2010). При экспрессии в ооцитах ClC-Ka/barttin и ClC-Kb/barttin обнаруживают резко различающиеся свойства гейтирования (Imbrici et al., 2014). В то время как абсолютные открытые вероятности ClC-Ka/barttin близки к 1 в клетках млекопитающих (Riazuddin et al., 2009), соответствующие значения очень малы в ооцитов Xenopus (Gradogna et al., 2010). Более того, ClC-K каналы, экспрессируемые в клетках млекопитающих, часто реагируют на фармакологическую модификацию иначе, чем каналы, экспрессируемые в ооцитах Xenopus (Imbrici et al., 2014). Причина этих функциональных различий пока не ясна. Могут быть еще неизвестные партнеры взаимодействия ClC-K/barttin, которые присутствуют в одной системе экспрессии, но не присутствуют в другой. Альтернативно, функциональные свойства каналов ClC-K/barttin могут зависеть от состава липидов.Хотя экспрессия в клетках млекопитающих, по-видимому, больше похожа на почечные клетки, чем на ооциты амфибий, в настоящее время невозможно судить, какой из двух различных биофизических и фармакологических фенотипов ближе к функциональным свойствам нативных каналов.

Хлорид, безусловно, является наиболее распространенным анионом in vivo , что также привело к обозначению каналов CLC как «хлоридных» вместо «анионных». Следует отметить, что фильтр селективности каналов CLC не позволяет точно различать различные виды анионов, рассматриваемых как проницаемость для других (нефизиологических) анионов, таких как I , F , SCN , NO . 3 или Br .Однако исследования с использованием другого распространенного физиологического аниона, HCO 3 , проводятся редко. Значительная проницаемость для бикарбоната была обнаружена в исследованиях ClC-5 в ооцитах Xenopus laevis (Mo et al., 1999), а математическое исследование потоков эпителиальных ионов в восходящем колене Генле предсказывает, что значительная бикарбонатная проводимость ClC- Kb необходим для правильной функции почек (Weinstein, 2010).

Двухствольные каналы CLC демонстрируют уникальные свойства одиночного канала

В настоящее время существуют одноканальные записи для большинства каналов CLC человека (рис. ) (Saviane et al., 1999; Фишер и др., 2010; Вайнбергер и др., 2012 г.; Штёльтинг и др., 2013). Таким образом, при анализе записей с мембранных участков, содержащих только один канал CLC, график амплитудной гистограммы показывает в общей сложности три пика, соответствующие закрытому каналу или открытию одной или двух протопор (правая сторона рисунков). Это свойство является результатом уникальной димерной архитектуры каналов CLC с двумя путями ионной проводимости.

Записи отдельных каналов или анализ шума записей целых ячеек предоставляют свойства отдельных каналов CLC.(A–D) 90 010 Репрезентативные одноканальные записи гомодимерного ClC-1, гомодимерного ClC-2, гетероконкатамерного ClC-1-ClC-2, а также ClC-Ka, коэкспрессированного с бартином. Все записи гомодимерных каналов показывают два отдельных открытых состояния, представляющих одну или две одновременно открытые протопоры. ClC-Ka/barttin демонстрирует высокую вероятность открытия, приближающуюся к 1, поэтому наблюдается мало отклонений от полностью открытого состояния. (A–C) были воспроизведены и изменены из Stölting et al. (2014) и (D) от Riazuddin et al.(2009). (E) Репрезентативный график среднего тока и дисперсии клеток HEK293T, экспрессирующих человеческий канал ClC-1 с заменой цистеина 277 на тирозин. Протокол напряжения (вверху), средний ток (в центре) и дисперсия (внизу) получены при pH 5,9, чтобы увеличить вероятность открытия каналов, содержащих этот конкретный мутант. (F) Построение графика отклонения от среднего тока не приводит к простому параболическому распределению. Как и ожидалось, для двухствольных каналов с отдельными протопорами и совместными воротами все точки данных попадают между теоретическим прогнозом для каналов с постоянно открытыми общими воротами (обозначаемыми как «i») или постоянно открытыми воротами протопор (обозначаемыми как «2i»).Переход от одной параболы (штриховая линия) к другой (линия) указывает на медленный переход быстрых ворот из закрытого состояния в открытое во время записи. (G) Линейное преобразование графика в (F) облегчает идентификацию изменений вероятности открытия быстрых ворот. (E-G) были воспроизведены и изменены из Weinberger et al. (2012).

Одноканальные записи прототипа ClC-0 выявили длительные периоды с закрытыми каналами, которые прерывались фазами, в которых обе протопоры быстро переключались между открытым и закрытым состояниями.Во время этих взрывоподобных фаз распределение вероятности встречи с любым из трех уровней амплитуды определяется почти исключительно быстрыми воротами протопор, тогда как длительные закрытые длительности основаны на медленных общих воротах. Поскольку индивидуальная фиксация протопор не зависит от соседней субъединицы, время, проведенное на каждом из трех уровней тока, распределяется биномиально, и такое поведение было названо «биномиальными всплесками» (Miller, 1982). ClC-1 и ClC-2 демонстрируют гейт-процессы, которые напоминают поведение ClC-0, с быстрым гейтированием протопор и медленными кооперативными процессами (рисунки) (Saviane et al., 1999; Аккарди и Пуш, 2000 г.; Суньига и др., 2004). Barttin, по-видимому, блокирует кооперативные ворота в открытой конформации, так что одноканальные записи каналов ClC-Ka/barttin показывают исключительно четное число протопор с независимыми воротами (Fischer et al., 2010). До сих пор не сообщалось об одноканальных записях в гетерологичных системах экспрессии для ClC-Kb.

Анализ гетеродимерных каналов, состоящих из одной субъединицы ClC-1 и одной субъединицы ClC-2, позволил по-новому взглянуть на молекулярную основу медленных кооперативных ворот (Stölting et al., 2014). В таких гетеродимерных каналах отсутствуют кооперативные ворота, но сохраняются два отдельных механизма быстрого и медленного входа для каждой протопоры. В гетеродимерах ClC-1-ClC-2 быстрое открытие протопор ClC-1 напоминает соответствующие процессы в гомодимерах ClC-1. Однако протопора ClC-1 удерживается закрытой при положительном потенциале с помощью новых медленных ворот, которые допускают только временные открытия в гетеродимерной сборке. Напротив, протопора ClC-2 активна при всех потенциалах и находится под контролем быстрых и медленных воротных процессов, которые кинетически отличаются от тех, которые идентифицированы для протопоры ClC-1.В одноканальных записях такое поведение приводило только к одному состоянию проводимости, соответствующему протопоре ClC-2 (рис. ). Эти результаты указывают на то, что общие ворота каналов CLC, в конечном счете, возникают из-за конформационных изменений внутри индивидуального протопора (Bennetts and Parker, 2013; Stölting et al., 2014). Гомодимеризация позволяет синхронизировать эти процессы и общий гейт. В гетеродимерах эта координация нарушена, так что медленные этапы ворот больше не являются кооперативными.

Амплитуды одного канала для протопора ClC-2 были значительно меньше в гетероконкатамерах, чем в гомодимерах ClC-2 (рис. ). В совокупности эти эксперименты демонстрируют, насколько тесно взаимодействуют две субъединицы в рамках одного индивидуального канала. Затвор и проникновение через каждый транспортный белок регулируется электростатическими взаимодействиями между заряженными боковыми цепями или спиральными дипольными моментами. Можно предположить, что изменения в ориентации определенных боковых цепей или спиралей посредством межсубъединичных взаимодействий могут регулировать электростатическое поле соседней субъединицы CLC и, таким образом, кооперативно детерминировать ворота и проникновение.

Анализ шума представляет собой альтернативный метод определения свойств отдельных каналов (Sigworth, 1980). Это особенно полезно для каналов с малой амплитудой унитарного тока и часто помогает коррелировать унитарные и макроскопические токи определенных ионных каналов. Такой анализ основан на предположении, что основные процессы стробирования являются стохастическими событиями и что небольшие отклонения в макроскопической амплитуде тока вызваны флуктуациями числа открытых каналов.В то время как текущий шум, создаваемый каналами только с одним уровнем проводимости, легко анализировать, двуствольная архитектура каналов CLC требует модификации такого анализа шума (Fischer et al., 2010; Weinberger et al., 2012).

Скачки напряжения вызывают релаксацию вероятности открытия зависимых от напряжения каналов от предыдущего равновесного значения к новому и приводят к зависящим от времени изменениям амплитуды тока. Во время этих токовых релаксаций амплитуда тока одного канала постоянна, тогда как количество открытых каналов изменяется.Повторная выборка откликов тока на один и тот же скачок напряжения (рисунок ) позволяет определить средний ток по всем зарегистрированным скачкам напряжения и средние отклонения для нескольких моментов времени после скачка напряжения. Для каналов только с одним состоянием проводимости график дисперсии тока (σ 2 ) по сравнению со средней амплитудой < I > (рис. ) дает параболическое распределение, которое зависит от: амплитуды одного канала ( i ) и количество каналов ( N ).

σ2=  i〈I〉−(〈I〉2N)

или после линеаризации делением дисперсии на ток

Некоторые CLC-каналы показывают значительное отклонение от этой теории, которое становится еще более очевидным после линеаризации параболического графика ( цифры). В основе этого своеобразного соотношения ток-дисперсия лежит двуствольная архитектура этих каналов. Взятие двух протопор с двумя структурно и кинетически различными процессами ворот позволяет удовлетворительно количественно оценить это поведение.Макроскопический ток каналов ХЖК определяется как произведение вероятности открытия каждых ворот, количества каналов и удвоенной амплитуды одиночной протопоры: P ( T ( T ) · P C ( T ( T )

Текущий дисперсию зависит от количества каналов ( N ), единственная амплитуда протопора ( I ) и зависящие от времени вероятности открытия для быстрых протопоровых ворот ( P p ( t )) и медленных общих ворот ( P c ( t )):

6 ) = N · 2 I · 2 I 2 · P P P ( T ) · P C ( T ) · (1 — 2 P р ( т ) ·  9 0005 P c ( t ) + P p ( t ))

Эти уравнения можно упростить до:

σ2=  (1+Pp(t))·i〈I〉−(〈I〉2N)

демонстрируя, что эта количественная обработка позволяет определить амплитуду одного канала, если известна одна из двух открытых вероятностей.Даже если график дисперсии тока не показывает очевидных отклонений от параболической формы, необходимо учитывать зависимость начального наклона от минимальной вероятности открытия протопоровых ворот ( P p ).

Во всех случаях текущая дисперсия должна находиться между двумя крайними значениями:

I〉22N)             для Pc(t)=1

Используя такой анализ, мы продемонстрировали, что мутация C277Y, вызывающая миотонию, приводит к значительному снижению вероятности медленного открытия ворот (Weinberger et al., 2012). Предполагая, что максимальное значение, равное удвоенному наименьшему определенному соотношению дисперсии/текущего тока, эти результаты также продемонстрировали уменьшенные амплитуды одного канала по сравнению с ClC-1 дикого типа из одноканальных записей. Это открытие является довольно неожиданным, поскольку С277 не участвует в формировании проводящего пути в известных трехмерных структурах. Это обеспечивает дополнительную поддержку понятия тесного взаимодействия субъединиц в определении свойств ворот и проникновения CLC-каналов.

Молекулярные детерминанты функции канала CLC

За последние 20 лет сочетание сайт-направленного мутагенеза и функционального анализа мутантных каналов позволило понять механизмы и детерминанты последовательности ворот канала CLC и проникновения анионов. Эксперименты по сайт-направленному мутагенезу на нескольких каналах CLC продемонстрировали, что один и тот же консервативный глутамат в начале спирали F, движение которого необходимо для транспорта протонов в антипортерах CLC, важен для быстрого запуска в ClC-0, ClC-1 и ClC-2. (Фальке и др., 1997; Дутцлер и др., 2003 г.; Нимейер и др., 2003; De Santiago et al., 2005) и поэтому был назван «запирающим глутаматом». В каналах ClC-K этот «запирающий глутамат» заменяется валином, поэтому часто предполагается, что ClC-Ka и ClC-Kb не имеют протопорных затворов. Тем не менее, одноканальные записи от ClC-Ka/barttin выявили короткие события стробирования и очень высокую вероятность открытия канала (Riazuddin et al., 2009; Fischer et al., 2010). Было обнаружено, что время, проведенное в открытом и закрытом состояниях, распределяется биномиально, а самый высокий наблюдаемый уровень проводимости всегда был кратным двум, демонстрируя, что наблюдаемые переходы открытия и закрытия вызваны отдельными воротами протопор без вмешательства постоянно открытых общих ворот (Riazuddin). и другие., 2009; Фишер и др., 2010). Гомологичный крысиный ClC-K1 также функционален в отсутствие бартина и, таким образом, дает возможность более подробно изучить влияние бартина на функцию ClC-K. В отсутствие бартина в rClC-K1 проявляются протопоры и общие вентильные процессы с противоположной зависимостью от напряжения. Совместная экспрессия с бартином приводит к постоянному открытию общих ворот, опять же, как показано биномиальным распределением гистограмм амплитуды для каждого состояния проводимости при совместной экспрессии с бартином (Fischer et al., 2010). Хотя результаты подразумевают, что боковые цепи, отдельные от исходного «запирающего глутамата», должны быть вовлечены в затвор протопор, точная молекулярная основа такого затвора еще не идентифицирована в каналах ClC-K.

В ClC-0, ClC-1 и ClC-2 цистеин находится рядом с интерфейсным доменом и в непосредственной близости от S ext (C212 в ClC-0, C277 в ClC-1 или C258 в ClC-2) играет решающую роль в медленном кооперативном гейтировании (Lin et al., 1999; Accardi et al., 2001; Zúñiga et al., 2004; Де Сантьяго и др., 2005 г.; Вайнбергер и др., 2012). Опять же, в каналах ClC-K отсутствует цистеин в этом положении, что позволяет предположить, что эта боковая цепь не требуется для общего управления воротами. Основываясь на трехмерных структурах CLC-антипортеров, недавно было высказано предположение, что медленное совместное запирание ClC-0 и ClC-1 зависит от остатка тирозина, который координирует центральный сайт связывания хлорида (Bennetts and Parker, 2013). Считается, что этот тирозин взаимодействует с глутаматом селектора в качестве последнего шага медленного селектора, чтобы закупорить или открыть пору.Однако до сих пор неизвестно, каким образом общие ворота одновременно передаются обеим протопорам. Неизвестно даже, находятся ли антипортеры в семействе CLC под контролем кооперативного воротного механизма. Однако на основании предыдущих исследований кажется разумным, что перегруппировка карбокси-конца может потребоваться для кооперативного гейтирования (Bykova et al., 2006; Garcia-Olivares et al., 2008; Ma et al., 2011; Stölting et al. ., 2013).

Преобразование антипортеров CLC в каналы/унипортеры

Для понимания структурных особенностей, отличающих анионный канал CLC от анион-протонного обменника, были предприняты попытки преобразовать антипортеры CLC в анионные каналы или наоборот.Однако пока эти попытки не увенчались полным успехом. Замена остатка глутамата («затворный глутамат» E148 в EcClC) в спирали F на аланин отменяет вторично-активный транспорт и делает возможным пассивное проникновение анионов (Accardi and Miller, 2004; Jayaram et al., 2008). Соответствующий обмен также устранил связь транспорта протонов с потоком хлорида в человеческих анион/протонных антипортерах ClC-4 и ClC-5 (Picollo and Pusch, 2005; Scheel et al., 2005). Другой остаток глутамата в EcClC (E203) также может быть нейтрализован заменой на аланин, чтобы нарушить связь транспорта хлоридов и протонов, что приведет к переключению на каналоподобный фенотип, возможно, из-за отсутствия внутреннего сайта связывания протонов (Accardi и другие., 2005). Некоторые замены центрального тирозина (Y445 в EcClC) также приводили к кажущемуся канальному фенотипу с сильным уменьшением наблюдаемой плотности анионов для S cen в сопутствующих рентгеновских кристаллических структурах (Accardi et al., 2006). Мутация E148 вместе с Y445 увеличивала транспорт унитарных анионов в EcClC выше значений, наблюдаемых для унипортеров, однако наблюдаемые скорости проводимости были значительно ниже соответствующих значений в каналах CLC (Jayaram et al., 2008). Следует отметить, однако, что все эти остатки в основном сохраняются даже в канальной ветви семейства CLC, что дает важную информацию о процессе проводимости анионов и протонов, но не позволяет продемонстрировать фактическую разницу между транспортерами и каналами из одного и того же семья.Сообщений о преобразовании канала CLC в антипорт пока нет.

Клеточная физиология и патофизиология каналов CLC

CLC-1

Скелетные мышцы взрослых уникальны среди возбудимых тканей благодаря высокой проводимости хлоридов в покое. Он превышает сарколеммальную калиевую проводимость более чем в четыре раза и настолько высок, что изменения внеклеточных концентраций хлоридов не изменяют потенциал покоя, а скорее приводят к изменениям внутриклеточного [Cl ] до тех пор, пока равновесный потенциал ионов хлора снова равняется потенциалу покоя мышц (Hodgkin and Horowicz, 1959; Bretag, 1987).Физиологическая роль ClC-1 стала ясна при изучении патофизиологии врожденной миотонии, редкого состояния человека, характеризующегося ригидностью мышц при резких резких движениях (Bryant and Morales-Aguilera, 1971; Adrian and Bryant, 1974). В миотонических мышечных волокнах мембранный потенциал не полностью реполяризуется после серии потенциалов действия во время произвольных сокращений, что приводит к так называемой постдеполяризации. Постдеполяризации могут приводить к длительной электрической активности мышечных волокон даже после прекращения активности нейронов и, таким образом, являются электрофизиологической основой ригидности мышц (Adrian and Bryant, 1974).Временной ход самого потенциала действия не изменяется в мышечных волокнах миотонической козы, что указывает на то, что ClC-1 не способствует реполяризации самого потенциала действия (Bryant, 1973).

Последеполяризация миотонических мышечных волокон происходит из-за накопления K + в Т-трубочках, что происходит как в нормальных, так и в миотонических мышцах во время повторяющихся потенциалов действия. В нормальных скелетных мышцах высокая проводимость хлоридов в состоянии покоя снижает константу длины сарколеммы и предотвращает распространение этой деполяризации вдоль сарколеммы.В отсутствие шунтирующей сарколеммальной хлоридной проводимости в миотонической мышце деполяризация t-трубочек приводит к деполяризации мембраны сарколеммы, вызывая устойчивую активность мышечного волокна. До сих пор ведутся споры о том, обеспечивает ли ClC-1 свою шунтирующую проводимость только через каналы, локализованные вдоль наружной сарколеммальной мембраны или также вдоль t-трубочек. Недавнее исследование представило доказательства однородного распределения в Т-трубочках и мембране сарколеммы (DiFranco et al., 2011), в то время как в другой статье описывается эксклюзивная экспрессия в поверхностной мембране (Lueck et al., 2010). Независимо от точной локализации, хлоридные каналы в мышцах позволяют волокнам скелетных мышц электрически переносить инвагинации t-тубулярной мембраны и последующее накопление калия (Рисунки).

ClC-1 является основным хлоридным каналом в мышцах. (A) В скелетных мышцах мембранный потенциал покоя определяется градиентом калия через сарколеммальную и Т-трубчатую мембраны.Потенциалы действия приводят к открытию кальциевых каналов L-типа (DHPR), которые, в свою очередь, открывают внутриклеточные каналы (RyR), высвобождающие кальций из саркоплазматического ретикулума, необходимый для сокращения мышцы. (B) Последовательность потенциалов действия приводит к перемещению калия через каналы во внеклеточную сторону. Поскольку диффузия ионов из Т-трубочек идет медленно, калий накапливается и вызывает временные изменения калиевого реверсивного потенциала, которые, однако, компенсируются высокой проводимостью сарколеммального хлорида. (C) В мышечных волокнах, экспрессирующих дисфункциональные каналы ClC-1, деполяризация t-трубочек распространяется на поверхностную мембрану и может запускать спонтанную генерацию новых потенциалов действия даже после окончания произвольного движения. Эта «последеполяризация» отмечена красным. (D) Репрезентативные записи мутантных каналов ClC-1, несущих болезнетворные мутации, иллюстрирующие разнообразные результаты замены отдельных аминокислот при гейтировании ClC-1.

ClC-1 был клонирован из скелетных мышц как первый член семейства CLC млекопитающих (Steinmeyer et al., 1991). Мутации в CLCN1 как генетическая основа врожденной миотонии доказали, что ClC-1 действительно представляет собой хлоридный канал взрослых скелетных мышц (Koch et al., 1992; George et al., 1993). ClC-1 демонстрирует внутреннюю проводимость унитарного тока при симметричных концентрациях хлоридов со значением примерно на 1,5 пСм ниже -85 мВ и в 10 раз более низкую проводимость при напряжениях, положительных по отношению к потенциалу обращения хлоридов (Pusch et al., 1994; Stölting et al. др., 2014). ClC-1 имеет открытую вероятность 0.38 при -85 мВ (Weinberger et al., 2012) и минимально открывается только во время подъема потенциала действия, что быстрее, чем время активации ClC-1 (Fahlke and Rüdel, 1995; Accardi and Pusch, 2000; Hebeisen). и Фальке, 2005). Эти специфические свойства анионной проводимости и гейтирования делают ClC-1 идеально подходящим для обеспечения большой проводимости хлорида в состоянии покоя с минимальным вмешательством в потенциал действия. Эти свойства сводят к минимуму приток Na + во время потенциала действия и, таким образом, снижают потребление АТФ после продолжительной мышечной активности, которая необходима для активной экструзии Na + с помощью Na + /K + -АТФазы.

Хотя потенциал-зависимое гейтирование ClC-1 не является строго необходимым для его физиологической функции, почти все болезнетворные мутации, которые были изучены, нарушают гейтирование канала [за заметным исключением G230E, который влияет на проникновение ионов и селективность ClC-1 (Фальке и др., 1997)]. Первая мутация миотонии, которая была функционально проанализирована, D136G (рис. 1), связывает открытие канала с внутриклеточной концентрацией хлорида и, таким образом, инвертирует зависимость ClC-1 от напряжения (Fahlke et al., 1995). D136G hClC-1 открывается только при напряжении ниже равновесного потенциала хлорида. Отток хлоридов при таких напряжениях будет снижать внутриклеточную концентрацию хлоридов до достижения потенциала реверсии хлоридов, подобного потенциалу покоя сарколеммы. При этом [Cl ] D136G hClC-1 будет постоянно закрыт, что полностью согласуется с низкой проводимостью хлоридов в покое и повышенной возбудимостью. D136G hClC-1 напоминает ClC-2 по многим свойствам и, таким образом, иллюстрирует важность специфичной для изоформ специализации внутри семейства CLC.Впоследствии было идентифицировано несколько мутаций, которые сместили кривую активации ClC-1 в сторону более деполяризованных потенциалов (Pusch et al., 1995; Rhodes et al., 1999; Wu et al., 2002) (рис. 1). Такие сдвиги уменьшают открытую вероятность hClC-1 при -85 мВ и, таким образом, снижают проводимость хлорида в покое. Сходное изменение ворот канала лежит в основе миотонии у коз (Beck et al., 1996). Другие мутации приводят к изменениям ворот, так что два процесса ворот развивают противоположный паттерн зависимости от напряжения, один стимулируется деполяризацией мембраны, а другой гиперполяризацией, как в каналах T550M ClC-1 (Warnstedt et al., 2002; Ву и др., 2002; Вайнбергер и др., 2012). За последние два десятилетия у пациентов с врожденной миотонией было обнаружено большое разнообразие болезнетворных мутаций. Эти мутации распространены по всей кодирующей области ClC-1, и их функциональный анализ дал много важных сведений о последовательностях, определяющих функцию канала CLC (Fahlke et al., 1995, 1997; Wollnik et al., 1997; Saviane et al. ., 1999; Richman et al., 2012; Weinberger et al., 2012; Lee et al., 2013).

Недавно новый вариант ClC-1 был идентифицирован экзономическим секвенированием у пациентов, страдающих идиопатической эпилепсией (Chen et al., 2013). Это исследование также показало транскрипты мРНК ClC-1 и белковые полосы, окрашенные антителами против ClC-1 в частях головного мозга человека. Эта новая роль и локализация ClC-1 может привести к новым перспективам физиологии каналов CLC в центральной нервной системе. Однако отсутствие центральных неврологических симптомов у пациентов с врожденной миотонией или у животных, моделирующих это заболевание, поднимает вопрос о том, как функциональные изменения ClC-1 могут способствовать развитию эпилепсии.

CLC-2

ClC-2 был обнаружен вскоре после ClC-1 как в возбудимых, так и в невозбудимых клетках (Thiemann et al., 1992). ClC-2 демонстрирует независимую от напряжения проводимость одного канала всего ~ 2,4 пСм на протопору (Stölting et al., 2013). Он закрывается при положительных потенциалах и активируется в течение очень медленного времени при гиперполяризации. После активации при отрицательных потенциалах напряжение возвращается к положительным потенциалам, что приводит к очень медленной деактивации тока. В то время как протопорные ворота полностью закрываются при положительных потенциалах, медленные общие ворота демонстрируют минимальную вероятность открытия значительно выше нуля (De Santiago et al., 2005; Гарсия-Оливарес и др., 2008). Сходные особенности гейтирования наблюдались в ооцитах Xenopus и в клетках млекопитающих, однако кинетика активации и деактивации была значительно медленнее в ооцитах. Кинетика гейтирования модифицируется связыванием нуклеотидов с карбокси-концом (Dhani et al., 2008; Stölting et al., 2013) и составом окружающих липидов (Hinzpeter et al., 2007). Также было обнаружено, что активация и деактивация ClC-2 значительно ускоряются делециями или модификациями карбокси- или амино-концевых доменов, что предполагает участие больших перестроек этих белковых доменов (Garcia-Olivares et al., 2008; Сен-Мартен и др., 2009 г.; Stölting et al., 2013), например, для ClC-0 и ClC-1 (Быкова и др., 2006; Ma et al., 2011).

Запирание ClC-2 зависит от внутриклеточного [Cl ], так что открытие канала происходит только при потенциалах, отрицательных по отношению к равновесному потенциалу Cl (Niemeyer et al., 2004). В клетках, в которых мембранный потенциал ограничен каналами различной селективности в сторону более отрицательных потенциалов, можно предположить, что ClC-2 будет оставаться открытым и обеспечивать отток анионов до тех пор, пока равновесный потенциал хлоридов не сравняется с мембранным потенциалом.Таким образом, ClC-2 может способствовать регуляции внутриклеточных концентраций анионов в нейронах, глии или оттоку хлоридов в эпителиальных клетках. Ранние исследования ClC-2, гетерологически экспрессируемого в ооцитах Xenopus , выявили активацию с помощью осмотических градиентов, подтверждая, что ClC-2 может быть вовлечен в клеточный осмотический гомеостаз (Gründer et al., 1992). Однако функциональные свойства ClC-2 явно отличаются от активируемых объемом анионных каналов (Nilius et al., 1997), а клетки, лишенные ClC-2, демонстрируют неизмененные активируемые объемом анионные потоки (Nehrke et al., 2002).

ClC-2 может собираться с дополнительными субъединицами, которые не требуются для функции ClC-2, а скорее определяют субклеточную локализацию и модифицируют селекцию канала в различных типах клеток. Первой описанной вспомогательной субъединицей ClC-2 был белок cereblon, который связывается с карбокси-концом ClC-2 и предположительно регулирует экспрессию функциональных каналов в сетчатке (Hohberger and Enz, 2009). Совсем недавно было показано, что новая субъединица под названием GlialCAM (синоним более раннего обозначения HepaCAM) связана с ClC-2 (Jeworutzki et al., 2012). GlialCAM представляет собой белок длиной 416 аминокислот с одним трансмембранным доменом и большим Ig-подобным аминоконцевым доменом V- и C2-типа. В гетерологичных системах экспрессии совместная экспрессия GlialCAM с ClC-2 переключала фенотип в сторону почти конститутивно открытого канала. Хотя GlialCAM взаимодействует только с ClC-2 in vivo из-за его специфичной для клеток экспрессии, было обнаружено, что он связывается с несколькими каналами CLC in vitro , такими как ClC-0, ClC-1 и ClC-K/barttin влияющие на локализацию и общие параметры ворот (Jeworutzki et al., 2014).

Токи ClC-2, записанные на срезах головного мозга животных, нокаутированных по GlialCAM, не сильно отличаются от соответствующих следов, полученных у животных дикого типа, что позволяет предположить, что GlialCAM не оказывает такого резкого эффекта на вход канала в нативных клетках, как в гетерологичной системе экспрессии ( Hoegg-Beiler и др., 2014). Работа над мышами с нокаутом MLC1 также показала, что MLC1, мембранный белок с неизвестной функцией, ассоциированный с мегалэнцефальной лейкоэнцефалопатией (Leegwater et al., 2001), может стабилизировать GlialCAM в плазматической мембране и, таким образом, действовать как дополнительный партнер по связыванию в комплексе ClC-2/GlialCAM (Hoegg-Beiler et al., 2014).

Среди наиболее понятных функций ClC-2 является отток хлоридов через базолатеральную мембрану в желудочно-кишечный тракт, облегчающий реабсорбцию NaCl и впоследствии H 2 O (рис. ) (Catalán et al., 2002, 2004). Предполагаемый активатор ClC-2, лубипростон, улучшает течение хронического идиопатического запора, вероятно, за счет стимуляции секреции хлоридов и воды в просвет толстой кишки.Успех этого лечения согласуется с ролью ClC-2 также в апикальной секреции хлоридов (Cuppoletti et al., 2004). Во время разработки ClC-2 сильно экспрессируется в легочной ткани и был предложен в качестве потенциального пути для замены отсутствующей проводимости хлоридов у пациентов, страдающих муковисцидозом (Schwiebert et al., 1998, -2). Однако мыши Clcn 2 -/- не страдают легочными заболеваниями, а дополнительный нокаут ClC-2 у мышей CFTR -/- не ухудшил фенотип муковисцидоза у этих животных (Zdebik et al. др., 2004). Исследования мышей с нокаутом также выявили дегенерацию яичек и дегенерацию сетчатки, что подчеркивает роль ClC-2 в пигментном эпителии сетчатки и в клетках Сертоли, где этот канал может участвовать в регуляции высокоспециализированной секреции жидкости этими тканями (Bösl et al. ., 2001). Хотя это и не связано с каким-либо почечным заболеванием, экспрессия ClC-2 также была обнаружена в почках (Thiemann et al., 1992). Анализ транскриптов мРНК выявил значительную экспрессию во всех сегментах нефрона, за исключением кортикального собирательного протока и наружного мозгового вещества собирательного протока, и было обнаружено, что он модулируется альдостероном у крыс (Ornellas et al., 2002). Было также показано, что ClC-2 экспрессируется в скелетных мышцах (Thiemann et al., 1992). Однако токи ClC-2 не могли быть зарегистрированы ни в почках, ни в скелетных мышцах. Вполне возможно, что ClC-2 может образовывать гетеродимеры в этих тканях, где экспрессируются другие каналы CLC, такие как ClC-1 (Lorenz et al., 1996; Stölting et al., 2014) или каналы ClC-K.

ClC-2 экспрессируется в эпителии, а также в возбудимых клетках. (A) В энтероцитах толстой кишки хлорид абсорбируется со стороны просвета через хлоридно-бикарбонатный обменник, а затем транспортируется через базолатеральный ClC-2 в интерстиций.Натрий следует через просветный канал или натрий/протонный обменник и транспортируется в интерстиций с помощью Na + /K + АТФазы (Catalán et al., 2002). (B) Роль ClC-2 в возбудимых клетках, таких как нейроны, все еще обсуждается. Вероятный механизм оставляет ClC-2 закрытым при эквивалентном калиевом мембранном потенциале покоя, но изменения потенциала реверсии хлоридов за счет притока Cl открывают ClC-2 и обеспечивают отток хлоридов через этот канал.Отток хлоридов, возможно, вызывает деполяризацию мембран и повышенную возбудимость. (C) Одноканальные записи мутантных каналов ClC-2 с мутациями, обнаруженными у пациентов с идиопатической эпилепсией. Эти мутации сокращают длительные закрытые состояния, вызванные закрытием общих ворот. (D) График вероятности нахождения канала ClC-2 в закрытом состоянии в течение указанного времени демонстрирует ассоциированные с заболеванием изменения общего. (E) W570X, недавно обнаруженный у пациентов с идиопатической генерализованной эпилепсией, вызывает такое же ускорение активации и деактивации ClC-2, как и ранее изученный мутант H573X, при экспрессии в клетках HEK293. (F) H573X частично открывает медленные ворота ClC-2. (C,D) были воспроизведены и изменены из Stölting et al. (2013). Данные H573X ClC-2 были воспроизведены и изменены из Garcia-Olivares et al. (2008).

ClC-2 экспрессируется в нейрональных и глиальных клетках (Staley, 1994; Nobile et al., 2000; Sìk et al., 2000), но его роль в центральной нервной системе еще недостаточно изучена. Мутации в гене CLCN2 были обнаружены у пациентов с идиопатической генерализованной эпилепсией, а также при лейкоэнцефалопатии (D’Agostino et al., 2004; Клефус-Ли и др., 2009 г.; Сен-Мартен и др., 2009 г.; Классен и др., 2011; Депьен и др., 2013; Штёльтинг и др., 2013). Мутации потери функции CLCN2 приводят к вакуолизации миелина в головном и спинном мозге и к легким неврологическим нарушениям, таким как мозжечковая атаксия (Depienne et al., 2013). Отсутствие ClC-2 вызывает аналогичные патологические изменения у пациентов-людей, наблюдаемые у мышей Clcn 2 -/- . Сходные изменения в морфологии мозга вызываются потерей GlialCam и MLC1, скорее всего, потому, что эти белки собираются в белковый комплекс, препятствующий образованию таких вакуолей.

Clcn 2 -/- мыши демонстрируют аномальную корковую активность и более высокую восприимчивость к индуцированным припадкам, но не проявляют явных признаков эпилептических припадков у животных (Blanz et al., 2007; Cortez et al., 2010). Изменения в динамической регуляции внутринейрональной концентрации хлоридов могут лежать в основе этой повышенной возбудимости (Blanz et al., 2007; Földy et al., 2010). Активация рецепторов GABA A гиперполяризует нейроны за счет временного притока хлоридов.ClC-2 может активироваться в результате увеличения внутриклеточного [Cl ] и обеспечивать путь выхода ионов хлорида (рис. 1). Этот механизм был впервые продемонстрирован в экспериментах, в которых ClC-2 экспрессировался в ганглиозных клетках задних корешков. Этот маневр уменьшил [Cl ] int и инвертировал деполяризующие токи в гиперполяризующие ГАМК (Staley et al., 1996). Другой возможный механизм постулирует, что каналы ClC-2 могут оставаться открытыми при положительном напряжении и обеспечивать реполяризующий приток хлорида (Ratté and Prescott, 2011).

Несколько миссенс-мутаций CLCN2 , обнаруженных у пациентов, страдающих идиопатической эпилепсией, изменяют гейтирование ClC-2 сходным образом (рисунки ), т. е. более быстрое время активации и деактивации. Это однородное функциональное последствие поддерживает представление о том, что эти изменения в закрытии каналов могут способствовать патогенезу эпилепсии. У мутанта ClC-2 отток хлорида после повторной стимуляции ГАМК будет активироваться быстрее и, таким образом, проводить деполяризующий ток с более быстрым началом, чем каналы дикого типа.Причинная роль мутаций CLCN2 в прошлом подвергалась сомнению несколькими авторами (Niemeyer et al., 2010; Depienne et al., 2013; Jentsch, 2013). Одним из аргументов было то, что эти мутации не связаны с эпилепсией в менделевском стиле. Некоторые из этих вариаций последовательности обнаруживают неполную косегрегацию и встречаются не только у пораженных, но и у здоровых особей одной и той же семьи. Однако такой тип наследования не является редкостью при идиопатической генерализованной эпилепсии. Появляется все больше доказательств того, что это заболевание возникает не просто из-за возникновения отдельных болезнетворных мутаций, а скорее является результатом сосуществования множественных вариаций последовательностей, влияющих на разные гены (Klassen et al., 2011). Проявление и тяжесть заболевания зависят от комбинированных функциональных последствий множественных совпадающих генетических факторов риска, способствующих повышенной возбудимости центральной нервной системы. Модель полигенной гетерогенности предполагает, что мутации CLCN2 и влияют на возбудимость нейронов, но эти изменения приводят только к эпилепсии вместе с мутациями в других генах (Klassen et al., 2011).

Одна из мутаций, связанных с идиопатической эпилепсией, W570X, также была идентифицирована в исследовании секвенирования генома пациентов с лейкоэнцефалопатией (Depienne et al., 2013). Эта мутация очень похожа на укорочение ClC-2, изученное ранее в нашей лаборатории, и вызывает сильное ускорение активации и инактивации ворот с почти постоянно открытыми медленными воротами (Рисунки) (Garcia-Olivares et al., 2008). Однако у пациента, страдающего лейкоэнцефалопатией, не было судорог, предположительно из-за почти полной деградации усеченного мутантного канала (Depienne et al., 2013).

CLC-Ka/CLC-Kb

ClC-Ka и ClC-Kb экспрессируются исключительно в нефроне и сосудистой полоске внутреннего уха (рис. ).Физиологическая роль этих белков была выяснена после появления мыши Clcnk 1 -/- (ClC-K1 является гомологом ClC-Ka для грызунов) с выраженным несахарным диабетом и сцеплением CLCNKB с Синдром Барттера, состояние человека, характеризующееся нарушением концентрации почечной мочи, что приводит к гипотензии с повышенными уровнями ренина и альдостерона (Simon et al., 1997; Matsuura et al., 1999). Эти данные свидетельствуют о том, что ClC-Ka и ClC-Kb имеют решающее значение для нормальной концентрации мочи.

ClC-K каналы необходимы для трансэпителиального транспорта растворенных веществ в петле Генле и сосудистой полоске внутреннего уха. (A) Экспрессия ClC-Ka/barttin и ClC-Kb/barttin в тонкой восходящей и толстой восходящей части петли Генле. Хлорид абсорбируется на просветной стороне либо за счет вторично-активного транспортного механизма, либо путем диффузии через апикальные каналы, а затем проводится через ClC-Ka/барттин или ClC-Kb/барттин к интерстициальной стороне. ClC-Ka/barttin необходим для пассивной реабсорбции NaCl в тонких восходящих ветвях.В толстой восходящей части ClC-Kb/barttin поддерживает базолатеральный отток хлоридов, необходимый для электрогенной абсорбции NaCl. Поглощение NaCl устанавливает трансэпителиальный потенциал, который дополнительно управляет парацеллюлярным потоком Mg 2+ или Ca 2+ . (B) ClC-Ka/barttin и ClC-Kb/barttin опосредуют базолатеральный отток хлоридов и поддерживают зарядку эндолимфы посредством секреции K + в сосудистой полоске. (C) Считается, что Барттин связывается со спиралью B (пурпурный) и J (синий) каналов ClC-K (Tajima et al., 2007). (D) Конфокальные флуоресцентные изображения (любезно предоставленные доктором Даниэлем Войцеховски) только YFP-ClC-Ka показывают преимущественное окрашивание внутриклеточных мембран (слева). При совместной экспрессии CFP-barttin ClC-Ka перемещается на плазматическую мембрану (правая сторона). (E) Барттин переключает ClC-Ka и ClC-Kb в активное состояние, как видно на нормализованном графике зависимости тока от напряжения. (F) Барттин увеличивает комплексное гликозилирование (#) и стабильность комплекса ClC-K/барттин в плазматической мембране. (A,B) изменены после Fahlke and Fischer (2010).

Первоначальные попытки охарактеризовать функцию этих каналов не увенчались успехом (Kieferle et al., 1994), поскольку ClC-Ka и Kb могут функционально экспрессироваться только вместе с дополнительной субъединицей бартина (Estévez et al., 2001; Waldegger et al., 2002; Шолль и др., 2006). Барттин был клонирован как продукт гена болезни синдрома Барттера 4 типа, сочетающего выраженные почечные симптомы других синдромов Барттера с нейросенсорной глухотой (Birkenhäger et al., 2001). Это белок из 320 аминокислот, который содержит два предполагаемых трансмембранных домена, за которыми следует длинный карбокси-конец. Укорочения barttin после положения 72 практически не затрагивают функцию ClC-K/barttin каналов в гетерологичных системах экспрессии (Scholl et al., 2006; Janssen et al., 2009). Предполагается, что взаимодействие Барттина с каналами ClC-K происходит вдоль двух трансмембранных спиралей B и J, но дополнительные подробности о взаимодействии канала и вспомогательной субъединицы все еще отсутствуют (рис. ) (Tajima et al., 2007).

У мышей и крыс ClC-K1, ClC-K2 и барттин распределяются, начиная с тонкого и заканчивая толстым восходящим протоком петли Генле и заканчивая собирательным протоком (Vandewalle et al., 1997; Waldegger et al. , 2002; Ниссан и др., 2004). Две изоформы ClC-K, однако, демонстрируют различия в их экспрессии в разных частях нефрона, так что в настоящее время считается, что каналы, состоящие из ClC-Ka и бартина, опосредуют прохождение Cl через эпителий преимущественно в тонком восходящем эпителии. конечности, в то время как ClC-Kb/barttin, как полагают, необходим для обратного захвата хлоридов в толстой восходящей конечности и поддержания трансэпителиального потенциала, который приводит к парацеллюлярной абсорбции различных катионов, включая Ca 2+ и Mg 2+ .ClC-K и barttin также проявляют обильную экспрессию в сосудистой полоске внутреннего уха. Каналы ClC-K/barttin обеспечивают базолатеральный отток ионов Cl , накопленных котранспортером NKCC1 Na + -K + -Cl , что необходимо для генерации эндокохлеарного потенциала.

Ни экспрессия ClC-Ka, ни ClC-Kb не приводят к видимым токам при отсутствии субъединицы бартина. Барттин выполняет несколько функций на каналах ClC-K.Он поддерживает выход из эндоплазматического ретикулума, стимулирует вставку и нарушает удаление ClC-Ks из поверхностной мембраны (рис. 1) (Scholl et al., 2006). Более того, барттин повышает стабильность белка ClC-K за счет стимуляции комплексного гликозилирования (Рисунки) (Hayama et al., 2003; Scholl et al., 2006; Janssen et al., 2009). ClC-Ka и ClC-Kb не функционируют без вспомогательной субъединицы и переключаются в проводящее состояние за счет ассоциации с бартином. При совместной экспрессии ClC-Ka и ClC-Kb проявляют независимые от времени, в основном не выпрямляющие токи (Janssen et al., 2009; Фишер и др., 2010). Каналы ClC-Ka/барттина постоянно открыты при положительном напряжении до -150 мВ. Спад вероятности размыкания при отрицательном напряжении до -150 мВ приводит к характерному «крючку» на макроскопических графиках вольт-амперной характеристики. Одноканальная проводимость ClC-Ka составляет примерно 30 пСм и, таким образом, значительно больше, чем у других каналов CLC (рис. 1). До сих пор не определены унитарные свойства ClC-Kb.

Несколько миссенс-мутаций CLCNKB были обнаружены у пациентов с синдромом Барттера (Simon et al., 1997; Фукуяма и др., 2004). Эти мутации обычно вызывают потерю функции канала и, таким образом, ожидается, что они уменьшат реабсорбцию воды, влияя на кортико-медуллярный осмотический градиент. Имеется одно сообщение о пациенте с комбинированными мутациями в CLCNKA и CLCNKB . Как и ожидалось, пациент страдает тяжелой формой почечной недостаточности и нейросенсорной глухотой, которые очень похожи на мутации в гене BSND , которые также влияют на оба хлоридных канала одновременно (Schlingmann et al., 2004). Одна мутация, предсказывающая T481S ClC-Kb, была обнаружена при генетическом скрининге когорт гипертоников. В гетерологичных системах экспрессии это позволяет открывать каналы ClC-Kb даже в отсутствие бартина (Jeck et al., 2004; Sile et al., 2009). Мутация может увеличить реабсорбцию соли и, следовательно, воды и, таким образом, повысить системное кровяное давление. Более того, увеличение токов хлора в сосудистых полосках увеличивает эндокохлеарный потенциал и тем самым снижает порог слышимости (Frey et al., 2006). Поскольку уменьшение объема крови за счет увеличения экскреции воды может усилить секрецию ренина и активировать ренин-ангиотензин-альдостероновую систему (РААС), потеря функции ClC-K/бартиновых каналов может увеличить риск сердечной недостаточности. Недавно сообщалось, что вариант CLCNKA , предсказывающий R83G ClC-Ka, приводит к потере функции этого канала и был предложен как фактор риска сердечной недостаточности (Cappola et al., 2011). Другие встречающиеся в природе варианты ClC-Ka, которые повышают системное кровяное давление после увеличения нагрузки NaCl, были связаны с хронической солевой гипертензией (Barlassina et al., 2007).

Важная роль ClC-K/бартиновых каналов в регуляции содержания соли и воды в организме делает эти каналы важной мишенью для фармакологического вмешательства (Picollo et al., 2004; Liantonio et al., 2006, 2012; Imbrici et al. др., 2014). Активаторы ClC-K/barttin могут корректировать потерю функции каналов, несущих естественные мутации, связанные с синдромом Барттера или идиопатической глухотой. Блокаторы ClC-K/каналов бартина могут служить диуретиками или антигипертензивными препаратами.Однако существуют потенциальные побочные эффекты, которые следует тщательно изучить. Слух оказывается гораздо более чувствительным к активности ClC-K каналов (Riazuddin et al., 2009), чем функция почек. Хотя гемато-лабиринтный барьер защищает эпителий внутреннего уха от общего кровообращения (Juhn and Rybak, 1981), некоторые соединения, такие как салицилат, фуросемид или аминогликозидные антибиотики, легко влияют на функцию внутреннего уха. Кроме того, длительное наблюдение за пациентами, страдающими синдромом Барттера, выявило стойкую гиперренинемию, вторичный гиперальдостеронизм и развитие протеинурии у многих пациентов, даже если другие симптомы достаточно хорошо контролировались (Bettinelli et al., 2007). Поэтому возможные побочные эффекты фармакологических изменений в функции ClC-K должны быть тщательно проверены и могут даже препятствовать широкому клиническому использованию.

Миссенс-мутации, препятствующие экспрессии barttin, приводят к очень тяжелому почечному фенотипу (Janssen et al., 2009; Fahlke and Fischer, 2010; Nomura et al., 2011), часто с терминальной стадией почечной недостаточности в молодом возрасте. Поскольку др. мутации BSND , которые также отменяют образование функционального ClC-K/barttin, действительно сохраняют почечную функцию, возникает соблазн предположить, выполняют ли эти каналы дополнительные функции в почечных клетках.Успешное лечение этих редких случаев может потребовать лучшего понимания взаимодействия ClC-K с субъединицей barttin. Однако в настоящее время неясно, как барттин взаимодействует с каналами ClC-K, а также неясно, может ли это взаимодействие быть нацелено на изменение функции канала.

Outlook

Анионные каналы существуют во всех клетках человеческого тела и выполняют множество физиологических функций. Важность этих каналов подчеркивается генетическими вариантами, связанными с основными заболеваниями.Эволюция привела к множеству семейств анионтранспортных белков с очень разными функциями и физиологическими ролями. Семейство CLC в настоящее время является крупнейшим известным семейством генов, кодирующих анионные каналы и транспортеры, и многие аспекты функции CLC-каналов уже хорошо изучены. Функцию канала CLC изучали с помощью записи патч-клэмпа целых клеток и одного канала и флуоресцентной визуализации. Трехмерные структуры родственных белков позволили получить детальное представление о молекулярной архитектуре этих белков.Используя модели животных с нокаутом и нокаутом, мы можем изучать влияние функций CLC на клеточные процессы.

CLC-каналы функционально сильно отличаются от потенциалзависимых катионных каналов, и многие из этих особых свойств обусловлены их эволюцией от транспортеров. Многие вторично-активные транспортеры могут принимать режимы проскальзывания, подобные каналам (DeFelice and Goswami, 2007). Однако в семействе CLC претерпело довольно строгое разделение этих мод на антипортеры и каналы без транспортной активности.Молекулярные детерминанты этой дифференциации не ясны. В то время как замена одной аминокислоты (D136G) может преобразовать один канал, ClC-1, в канал со свойствами, очень похожими на ClC-2, еще не удалось преобразовать канал CLC в переносчик CLC. Каналы CLC привлекли большое внимание благодаря своей уникальной двуствольной конструкции. Мы до сих пор не понимаем молекулярных функций и физиологического воздействия этой любопытной конструкции. Как эти две субъединицы взаимодействуют друг с другом и каково физиологическое преимущество наличия двух более или менее синхронизированных пор?

Недавно предсказанная локализация ClC-1 в центральной нервной системе поднимает вопросы относительно потенциальной роли этого канала в этой системе органов.До сих пор неясно, как ClC-2 предотвращает нейродегенерацию и какую роль мутантный ClC-2 играет в повышенной возбудимости центральной нервной системы. ClC-Ka и -Kb являются важными фармакологическими мишенями, однако ни одно соединение, нацеленное на эти каналы, еще не вошло в клиническую практику. Возможное образование гетеродимерных каналов CLC со свойствами, сильно отличающимися от свойств гомодимерных каналов, также требует дальнейшего изучения. Хотя существует много знаний о хлоридной проводимости каналов CLC, возможно, стоит также изучить проникновение бикарбоната.Нам также не хватает полного молекулярного понимания того, как вспомогательные субъединицы, такие как barttin или GlialCAM, модифицируют CLC-каналы.

Изучение семейства CLC всегда было обусловлено как интересом к биофизическим свойствам, так и их физиологической значимостью. Последние 25 лет предоставили знания и инструменты для решения многих остающихся вопросов. Мы надеемся, что эта работа приведет к детальному пониманию молекулярной физиологии и патофизиологии этих каналов и может улучшить качество жизни многих пациентов с редкими или распространенными заболеваниями.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Функция и дисфункция CLC-каналов в норме и при патологии

Abstract

CLC-каналы и транспортеры экспрессируются в большинстве тканей и выполняют разнообразные функции. Существует четыре канала CLC человека, ClC-1, ClC-2, ClC-Ka и ClC-Kb, и пять транспортеров CLC, от ClC-3 до -7.Некоторые из каналов CLC дополнительно связаны с дополнительными субъединицами. В то время как barttin является обязательным для функциональной экспрессии ClC-K, GlialCam является факультативной субъединицей ClC-2, которая модифицирует гейтирование и, таким образом, увеличивает функциональную вариабельность внутри семейства CLC. Специфичные для изоформ ионная проводимость и свойства ворот оптимизируют отдельные каналы CLC для их клеточных задач. ClC-1 предпочтительно проводит при отрицательном напряжении, и получающееся в результате выпрямление внутрь обеспечивает большую проводимость хлорида в состоянии покоя без вмешательства в потенциал действия мышцы.Эксклюзивное открытие при напряжениях, отрицательных по отношению к потенциалу реверсии хлоридов, позволяет ClC-2 регулировать внутриклеточные концентрации хлоридов. ClC-Ka и ClC-Kb в равной степени подходят для входящих и исходящих токов для поддержки трансцеллюлярных потоков хлоридов. Каждый ген канала CLC человека был связан с генетическим заболеванием, и изучение этих мутаций предоставило много информации о физиологических ролях и молекулярных основах функции канала CLC. Мутации в гене, кодирующем ClC-1, вызывают врожденную миотонию, заболевание, характеризующееся повышенной возбудимостью сарколеммы и ригидностью мышц.Потеря функции каналов ClC-Kb/барттина ухудшает резорбцию NaCl в колене Генле и вызывает гипонатриемию, гиповолемию и гипотензию у пациентов, страдающих синдромом Барттера. Мутации CLCN2 были обнаружены у пациентов с расстройствами ЦНС, но функциональная роль этой изоформы до сих пор не выяснена. Недавние связи между ClC-1 и эпилепсией и ClC-Ka и сердечной недостаточностью предполагают новые клеточные функции этих белков. Этот обзор направлен на обзор знаний о физиологических и патофизиологических функциях каналов CLC человека в свете недавних открытий биофизических, физиологических и генетических исследований.

Ключевые слова:

Ключевые слова: канал CLC, анионный канал, патч-кламп, врожденная миотония, синдром Барттера, лейкенцефалопатия (1990) установили семейство CLC белков-транспортеров анионов (рис. 1). Семейство CLC включает девять белков CLC человека, от ClC-1 до -7, а также белки ClC-Ka и -Kb. Одноканальные записи на ClC-0 выявили унитарную проводимость около 10 пСм (Miller, 1982), и, поскольку это значение предсказывает скорость транспорта, намного превышающую максимальные скорости переносчиков и насосов, почти не оставалось сомнений в том, что этот белок опосредует диффузию анионов через мембрану. водные проводящие пути.Унитарные амплитуды тока ClC-1 и ClC-2 подтверждали эту идею (Pusch et al., 1994; Weinreich, Jentsch, 2001), так что изначально предполагалось, что все члены семейства представляют собой анионные каналы. Таким образом, стало неожиданностью, когда было показано, что бактериальный гомолог E. coli функционирует как сопряженный анион/протонный обменник (Accardi and Miller, 2004). Последовательный анализ транспортных механизмов изоформ CLC человека показал, что пять из девяти CLC человека, от ClC-3 до ClC-7, представляют собой анион-протонные обменники, а не анионные каналы (Picollo and Pusch, 2005; Scheel et al., 2005; Neagoe и др., 2010; Лейл и др., 2011; Гусман и др., 2013). Таким образом, семейство CLC объединяет две функциональные группы с термодинамически разными транспортными процессами. Все экспериментальные данные, представленные до сих пор, подтверждают близкое структурное сходство членов семейства CLC и демонстрируют, что транспортные белки схожей структуры могут специализироваться в ионных каналах или транспортерах.

Семейство транспортных белков CLC включает хлоридные каналы и обменники хлорид/протон.(A) Филограмма демонстрирует раннее разделение белков CLC человека на одну ветвь хлоридных каналов, охватывающую ClC-1, ClC-2, ClC-Ka и ClC-Kb. Антипортеры хлорида / протона включают ClC-3 до -7. Каналам ClC-K требуется субъединица barttin, в то время как ClC-7 зависит от присутствия Ostm1 для нормального функционирования. Недавно GlialCAM был идентифицирован как дополнительная субъединица ClC-2. (B) Вид димера cmClC [идентификатор PDB: 3ORG (Feng et al., 2010)] в виде ленты.Одна субъединица показана светло-серым, а другая субъединица показана цветом от начала B-спирали синим до карбоксиконца красным. Верхняя часть белка включает трансмембранное ядро, а нижняя красная часть содержит карбоксиконцы с доменами CBS. (C) Более близкий вид некоторых критических остатков, координирующих ионы хлорида в ecClC (идентификатор PDB: 1OTS). Остатки Y445 и S107, окрашенные в пурпурный цвет, отвечают за связывание хлорида (зеленая сфера) в S cen , а также предполагается, что они имеют решающее значение для медленного открытия каналов CLC.E148 представляет собой так называемый «запирающий глутамат», колеблющийся от S cen до S ext , и считается, что он активно участвует в быстром включении протопор каналов CLC.

CLC-каналы и транспортеры выполняют различные физиологические задачи. В то время как CLC-обменники в основном экспрессируются во внутриклеточных компартментах, таких как эндосомы или лизосомы, и, по-видимому, вносят вклад в регуляцию «домашнего хозяйства» этих органелл, CLC-каналы расположены в поверхностной мембране возбудимых и эпителиальных клеток и способствуют регуляции возбудимости мембраны, а также транспорт электролитов, воды и питательных веществ.В этом обзоре мы сосредоточимся исключительно на канальной ветви семейства CLC, резюмируя их функции, их клеточные роли и возможное участие в заболеваниях.

Молекулярная физиология каналов CLC

Структурные детерминанты функции канала CLC

До сих пор не сообщалось о трехмерной структуре высокого разрешения для канала CLC. Однако анион/протонные обменники CLC были кристаллизованы из нескольких прокариотических и эукариотических видов (Dutzler et al., 2002; Аккарди и др., 2006 г.; Лобет и Дутцлер, 2006 г.; Фэн и др., 2010; Робертсон и др., 2010 г.; Джаярам и др., 2011 г.; Лим и др., 2012). Поскольку структурные свойства транспортеров CLC хорошо передаются для исследований структурно-функциональных функций, выполненных на каналах CLC (Miller, 2003), обычно предполагается, что каналы CLC структурно очень похожи на транспортеры CLC.

Все белки CLC собраны в виде димеров, причем каждая субъединица имеет 18 трансмембранных спиралей (обозначенных от A до R), за которыми следует цитозольный карбоксиконец, содержащий два консервативных домена цистатионин-ß-синтазы (CBS) в эукариотических CLC (Bateman, 1997). ) (Фигура ).Каждая субъединица связывает анионы без участия других субъединиц — в полном согласии с двумя отдельными активными центрами, которые транспортируют анионы независимо в двух соседних субъединицах. Эта своеобразная архитектура уже была предложена на основе ранних одноканальных записей, которые демонстрировали два равноотстоящих состояния проводимости и предполагали существование двух путей ионной проводимости, так называемых протопор, для каждого отдельного канала CLC (Miller, 1982; Miller and White, 1984). ). Три отдельных сайта связывания хлоридов внутри каждой субъединицы были идентифицированы в трехмерных структурах, S int , S cen и S ext , названных в честь их положения относительно вне- или внутриклеточной стороны плазмы. мембрана.Центральное положение образует значительную часть фильтра селективности с консервативными аминокислотами S107, I109, F357 и Y445 в дополнение к менее консервативным F348 и I356 (рисунок; все положения даны для EcClC), которые координируют ион хлорида в пределах проводимости. пути (Dutzler et al., 2002, 2003; Lobet and Dutzler, 2006). Отсутствуют полные положительные заряды, например, от боковых цепей аргинина или лизина, участвующих в формировании сайтов связывания анионов, что согласуется с представлением о том, что белки CLC используют спиральные дипольные моменты для создания положительного электростатического потенциала, необходимого для анионной селективности (Dutzler et al., 2002; Гуо и Маккиннон, 2005).

Отдельные структуры переносчиков CLC демонстрируют сходную складку остова, но, по-видимому, представляют разные конформации цикла обмена Cl /H + . Сравнение этих конформаций показывает движение консервативной боковой цепи глутамата, E148 в EcClC (рис. ), изнутри наружу пути проведения, переключающегося с S cen на S ext . Такие движения зависят от статуса протонирования и, вероятно, объясняют перенос протонов в стехиометрии от 2 Cl до 1 H + (Dutzler et al., 2003; Аккарди и Миллер, 2004 г.; Фэн и др., 2010; Пиколло и др., 2012).

Известно, что два карбоксиконцевых домена CBS эукариотических каналов CLC взаимодействуют и образуют внутримолекулярные димерные комплексы. Частичное удаление доменов CBS может вызвать либо потерю функции, либо изменения в закрытии каналов или внутриклеточном распределении (Maduke et al., 1998; Estévez et al., 2004; Hebeisen et al., 2004; Hebeisen and Fahlke, 2005; Гарсия-Оливарес и др., 2008). Недавняя структура эукариотического транспортера CLC предполагает взаимодействие между доменами CBS и внутриклеточными полюсами спиралей D и R.Поскольку эти спирали содержат боковые цепи серина и тирозина, координирующие S cen (S107 и Y445 в EcClC), это взаимодействие обеспечивает структурную основу для регуляции функции CLC с помощью кларбоксиль-концевых доменов (Hebeisen and Fahlke, 2005; Feng et al. , 2010). Дополнительные межсубъединичные взаимодействия димеров CBS наблюдались in vitro для изолированных карбокси-концов ClC-5 и ClC-Kb (Meyer et al., 2007; Martinez and Maduke, 2008). Такие взаимодействия могут играть роль в межсубъединичной коммуникации и могут способствовать кооперативным гейт-процессам (Быкова и др., 2006).

Функциональные свойства каналов CLC в экспериментах по фиксации напряжения

Гетерологическая экспрессия каналов CLC в ооцитах Xenopus и клетках млекопитающих позволила провести детальный функциональный анализ всех каналов CLC человека. На рисунке показаны записи пэтч-клэмп цельных клеток из клеток HEK293, сверхэкспрессирующих каналы CLC человека, и иллюстрируется функциональное разнообразие этих различных белков. Для всех записей клетки подвергались почти симметричному распределению хлорида поперек плазматической мембраны, держались на уровне 0 мВ, и применялись скачки напряжения в широком диапазоне.

Записи пэтч-клэмп цельных клеток демонстрируют функциональную изменчивость каналов CLC человека. (A-D) Репрезентативные токовые ответы клеток HEK293T, экспрессирующих ClC-1, ClC-2, ClC-Ka/barttin или ClC-Kb/barttin, на указанные протоколы напряжения (левый столбец). В правом столбце показаны зависимости от напряжения вероятностей открытия быстрых протопор (темные кружки) и медленных общих ворот (светлые кружки), а также вероятности того, что канал будет проводящим (жирная линия).Запись ClC-1 воспроизведена из Weinberger et al. (2012), в то время как записи ClC-Ka и -Kb были воспроизведены из Riazuddin et al. (2009).

В то время как амплитуды тока ClC-Ka/barttin и ClC-Kb/barttin почти не зависят от времени, скачки напряжения приводят к зависимой от времени и напряжения релаксации амплитуды тока ClC-1 и ClC-2, которую можно использовать для кинетический анализ ворот канала. Изменения макроскопической амплитуды тока обычно следуют сумме двух экспоненциальных функций с отдельными временными константами.Две константы времени активации и деактивации обусловлены существованием двух воротных механизмов, которые либо действуют на отдельные протопоры, либо совместно на оба протопора (Miller, 1982). Во всех CLC-каналах млекопитающих открытие протопор примерно в 10 раз быстрее, чем обычное открытие (Miller, 1982; Saviane et al., 1999; Fischer et al., 2010; Stölting et al., 2013), что привело к синонимическому использованию термины быстрые/протопоровые ворота и медленные/общие ворота. Для многих каналов эти кинетические различия использовались для разделения двух процессов при записи макроскопических токов.Мгновенная амплитуда тока в хвостовом импульсе фиксированного напряжения переводится в относительную вероятность открытого канала в конце предшествующего испытательного напряжения (Hodgkin and Huxley, 1952). Вставка короткого тестового импульса в напряжение, при котором два процесса стробирования достаточно различаются по скорости, только манипулирует быстрым стробом и, таким образом, эффективно фиксирует его с одинаковой вероятностью открытия для всех предыдущих шагов напряжения. Такой подход позволяет измерять зависимость медленного стробирования от напряжения изолированно.Если предположить, что процессы быстрой и медленной селекции независимы, вероятность открытия быстрых ворот может быть рассчитана как отношение общей вероятности открытия канала к проценту открытых медленных ворот (Accardi and Pusch, 2000).

Хлоридный канал ClC-1 скелетных мышц (рис. ) открыт при 0 мВ, с быстрыми и медленными воротами, которые оба активируются деполяризацией мембраны (Accardi and Pusch, 2000). График зависимости амплитуды тока от мембранного потенциала показывает проводимость внутреннего выпрямления (Fahlke et al., 1995). Повсеместно экспрессируемый ClC-2 закрывается при положительном потенциале и активируется в течение очень медленного времени при гиперполяризации мембраны (рис. 1) (De Santiago et al., 2005). Запуск ClC-2 снова характеризуется двумя кинетически различными процессами ворот, которые оба активируются гиперполяризацией, а не деполяризацией, как в ClC-1. Как ClC-1, так и ClC-2 демонстрируют сильно выпрямляющие макроскопические амплитуды тока внутрь, но с другой механистической основой. Выпрямление каналов ClC-1 внутрь происходит из-за зависящей от напряжения унитарной проводимости, которая уменьшается при положительном напряжении примерно до 10% от проводимости при отрицательном потенциале (Pusch et al., 1994; Фальке и др., 1995; Рычков и др., 1998; Штёльтинг и др., 2014). Напротив, унитарные проводимости тока ClC-2 не зависят от напряжения, а выпрямление токов ClC-2 происходит из-за зависящего от напряжения стробирования, которое закрывает быстрый затвор при положительном напряжении до 0 мВ (Stölting et al., 2013).

ClC-Ka (рис. ) и ClC-Kb (рис. ) могут функционально экспрессироваться только вместе с дополнительной субъединицей барттина (Estévez et al., 2001; Waldegger et al., 2002; Scholl et al., 2006; Fischer et al. др., 2010). В клетках млекопитающих токи ClC-Kb/барттина не зависят от времени с небольшим двунаправленным выпрямлением. Напротив, каналы ClC-Ka/barttin очень быстро закрываются при переходе к отрицательному напряжению до -100 мВ. Эти очень быстрые процессы, вероятно, соответствуют быстрому закрытию протопор в этих каналах (Riazuddin et al., 2009; Fischer et al., 2010). При экспрессии в ооцитах ClC-Ka/barttin и ClC-Kb/barttin обнаруживают резко различающиеся свойства гейтирования (Imbrici et al., 2014). В то время как абсолютные открытые вероятности ClC-Ka/barttin близки к 1 в клетках млекопитающих (Riazuddin et al., 2009), соответствующие значения очень малы в ооцитов Xenopus (Gradogna et al., 2010). Более того, ClC-K каналы, экспрессируемые в клетках млекопитающих, часто реагируют на фармакологическую модификацию иначе, чем каналы, экспрессируемые в ооцитах Xenopus (Imbrici et al., 2014). Причина этих функциональных различий пока не ясна. Могут быть еще неизвестные партнеры взаимодействия ClC-K/barttin, которые присутствуют в одной системе экспрессии, но не присутствуют в другой. Альтернативно, функциональные свойства каналов ClC-K/barttin могут зависеть от состава липидов.Хотя экспрессия в клетках млекопитающих, по-видимому, больше похожа на почечные клетки, чем на ооциты амфибий, в настоящее время невозможно судить, какой из двух различных биофизических и фармакологических фенотипов ближе к функциональным свойствам нативных каналов.

Хлорид, безусловно, является наиболее распространенным анионом in vivo , что также привело к обозначению каналов CLC как «хлоридных» вместо «анионных». Следует отметить, что фильтр селективности каналов CLC не позволяет точно различать различные виды анионов, рассматриваемых как проницаемость для других (нефизиологических) анионов, таких как I , F , SCN , NO . 3 или Br .Однако исследования с использованием другого распространенного физиологического аниона, HCO 3 , проводятся редко. Значительная проницаемость для бикарбоната была обнаружена в исследованиях ClC-5 в ооцитах Xenopus laevis (Mo et al., 1999), а математическое исследование потоков эпителиальных ионов в восходящем колене Генле предсказывает, что значительная бикарбонатная проводимость ClC- Kb необходим для правильной функции почек (Weinstein, 2010).

Двухствольные каналы CLC демонстрируют уникальные свойства одиночного канала

В настоящее время существуют одноканальные записи для большинства каналов CLC человека (рис. ) (Saviane et al., 1999; Фишер и др., 2010; Вайнбергер и др., 2012 г.; Штёльтинг и др., 2013). Таким образом, при анализе записей с мембранных участков, содержащих только один канал CLC, график амплитудной гистограммы показывает в общей сложности три пика, соответствующие закрытому каналу или открытию одной или двух протопор (правая сторона рисунков). Это свойство является результатом уникальной димерной архитектуры каналов CLC с двумя путями ионной проводимости.

Записи отдельных каналов или анализ шума записей целых ячеек предоставляют свойства отдельных каналов CLC.(A–D) 90 010 Репрезентативные одноканальные записи гомодимерного ClC-1, гомодимерного ClC-2, гетероконкатамерного ClC-1-ClC-2, а также ClC-Ka, коэкспрессированного с бартином. Все записи гомодимерных каналов показывают два отдельных открытых состояния, представляющих одну или две одновременно открытые протопоры. ClC-Ka/barttin демонстрирует высокую вероятность открытия, приближающуюся к 1, поэтому наблюдается мало отклонений от полностью открытого состояния. (A–C) были воспроизведены и изменены из Stölting et al. (2014) и (D) от Riazuddin et al.(2009). (E) Репрезентативный график среднего тока и дисперсии клеток HEK293T, экспрессирующих человеческий канал ClC-1 с заменой цистеина 277 на тирозин. Протокол напряжения (вверху), средний ток (в центре) и дисперсия (внизу) получены при pH 5,9, чтобы увеличить вероятность открытия каналов, содержащих этот конкретный мутант. (F) Построение графика отклонения от среднего тока не приводит к простому параболическому распределению. Как и ожидалось, для двухствольных каналов с отдельными протопорами и совместными воротами все точки данных попадают между теоретическим прогнозом для каналов с постоянно открытыми общими воротами (обозначаемыми как «i») или постоянно открытыми воротами протопор (обозначаемыми как «2i»).Переход от одной параболы (штриховая линия) к другой (линия) указывает на медленный переход быстрых ворот из закрытого состояния в открытое во время записи. (G) Линейное преобразование графика в (F) облегчает идентификацию изменений вероятности открытия быстрых ворот. (E-G) были воспроизведены и изменены из Weinberger et al. (2012).

Одноканальные записи прототипа ClC-0 выявили длительные периоды с закрытыми каналами, которые прерывались фазами, в которых обе протопоры быстро переключались между открытым и закрытым состояниями.Во время этих взрывоподобных фаз распределение вероятности встречи с любым из трех уровней амплитуды определяется почти исключительно быстрыми воротами протопор, тогда как длительные закрытые длительности основаны на медленных общих воротах. Поскольку индивидуальная фиксация протопор не зависит от соседней субъединицы, время, проведенное на каждом из трех уровней тока, распределяется биномиально, и такое поведение было названо «биномиальными всплесками» (Miller, 1982). ClC-1 и ClC-2 демонстрируют гейт-процессы, которые напоминают поведение ClC-0, с быстрым гейтированием протопор и медленными кооперативными процессами (рисунки) (Saviane et al., 1999; Аккарди и Пуш, 2000 г.; Суньига и др., 2004). Barttin, по-видимому, блокирует кооперативные ворота в открытой конформации, так что одноканальные записи каналов ClC-Ka/barttin показывают исключительно четное число протопор с независимыми воротами (Fischer et al., 2010). До сих пор не сообщалось об одноканальных записях в гетерологичных системах экспрессии для ClC-Kb.

Анализ гетеродимерных каналов, состоящих из одной субъединицы ClC-1 и одной субъединицы ClC-2, позволил по-новому взглянуть на молекулярную основу медленных кооперативных ворот (Stölting et al., 2014). В таких гетеродимерных каналах отсутствуют кооперативные ворота, но сохраняются два отдельных механизма быстрого и медленного входа для каждой протопоры. В гетеродимерах ClC-1-ClC-2 быстрое открытие протопор ClC-1 напоминает соответствующие процессы в гомодимерах ClC-1. Однако протопора ClC-1 удерживается закрытой при положительном потенциале с помощью новых медленных ворот, которые допускают только временные открытия в гетеродимерной сборке. Напротив, протопора ClC-2 активна при всех потенциалах и находится под контролем быстрых и медленных воротных процессов, которые кинетически отличаются от тех, которые идентифицированы для протопоры ClC-1.В одноканальных записях такое поведение приводило только к одному состоянию проводимости, соответствующему протопоре ClC-2 (рис. ). Эти результаты указывают на то, что общие ворота каналов CLC, в конечном счете, возникают из-за конформационных изменений внутри индивидуального протопора (Bennetts and Parker, 2013; Stölting et al., 2014). Гомодимеризация позволяет синхронизировать эти процессы и общий гейт. В гетеродимерах эта координация нарушена, так что медленные этапы ворот больше не являются кооперативными.

Амплитуды одного канала для протопора ClC-2 были значительно меньше в гетероконкатамерах, чем в гомодимерах ClC-2 (рис. ). В совокупности эти эксперименты демонстрируют, насколько тесно взаимодействуют две субъединицы в рамках одного индивидуального канала. Затвор и проникновение через каждый транспортный белок регулируется электростатическими взаимодействиями между заряженными боковыми цепями или спиральными дипольными моментами. Можно предположить, что изменения в ориентации определенных боковых цепей или спиралей посредством межсубъединичных взаимодействий могут регулировать электростатическое поле соседней субъединицы CLC и, таким образом, кооперативно детерминировать ворота и проникновение.

Анализ шума представляет собой альтернативный метод определения свойств отдельных каналов (Sigworth, 1980). Это особенно полезно для каналов с малой амплитудой унитарного тока и часто помогает коррелировать унитарные и макроскопические токи определенных ионных каналов. Такой анализ основан на предположении, что основные процессы стробирования являются стохастическими событиями и что небольшие отклонения в макроскопической амплитуде тока вызваны флуктуациями числа открытых каналов.В то время как текущий шум, создаваемый каналами только с одним уровнем проводимости, легко анализировать, двуствольная архитектура каналов CLC требует модификации такого анализа шума (Fischer et al., 2010; Weinberger et al., 2012).

Скачки напряжения вызывают релаксацию вероятности открытия зависимых от напряжения каналов от предыдущего равновесного значения к новому и приводят к зависящим от времени изменениям амплитуды тока. Во время этих токовых релаксаций амплитуда тока одного канала постоянна, тогда как количество открытых каналов изменяется.Повторная выборка откликов тока на один и тот же скачок напряжения (рисунок ) позволяет определить средний ток по всем зарегистрированным скачкам напряжения и средние отклонения для нескольких моментов времени после скачка напряжения. Для каналов только с одним состоянием проводимости график дисперсии тока (σ 2 ) по сравнению со средней амплитудой < I > (рис. ) дает параболическое распределение, которое зависит от: амплитуды одного канала ( i ) и количество каналов ( N ).

σ2=  i〈I〉−(〈I〉2N)

или после линеаризации делением дисперсии на ток

Некоторые CLC-каналы показывают значительное отклонение от этой теории, которое становится еще более очевидным после линеаризации параболического графика ( цифры). В основе этого своеобразного соотношения ток-дисперсия лежит двуствольная архитектура этих каналов. Взятие двух протопор с двумя структурно и кинетически различными процессами ворот позволяет удовлетворительно количественно оценить это поведение.Макроскопический ток каналов ХЖК определяется как произведение вероятности открытия каждых ворот, количества каналов и удвоенной амплитуды одиночной протопоры: P ( T ( T ) · P C ( T ( T )

Текущий дисперсию зависит от количества каналов ( N ), единственная амплитуда протопора ( I ) и зависящие от времени вероятности открытия для быстрых протопоровых ворот ( P p ( t )) и медленных общих ворот ( P c ( t )):

6 ) = N · 2 I · 2 I 2 · P P P ( T ) · P C ( T ) · (1 — 2 P р ( т ) ·  9 0005 P c ( t ) + P p ( t ))

Эти уравнения можно упростить до:

σ2=  (1+Pp(t))·i〈I〉−(〈I〉2N)

демонстрируя, что эта количественная обработка позволяет определить амплитуду одного канала, если известна одна из двух открытых вероятностей.Даже если график дисперсии тока не показывает очевидных отклонений от параболической формы, необходимо учитывать зависимость начального наклона от минимальной вероятности открытия протопоровых ворот ( P p ).

Во всех случаях текущая дисперсия должна находиться между двумя крайними значениями:

I〉22N)             для Pc(t)=1

Используя такой анализ, мы продемонстрировали, что мутация C277Y, вызывающая миотонию, приводит к значительному снижению вероятности медленного открытия ворот (Weinberger et al., 2012). Предполагая, что максимальное значение, равное удвоенному наименьшему определенному соотношению дисперсии/текущего тока, эти результаты также продемонстрировали уменьшенные амплитуды одного канала по сравнению с ClC-1 дикого типа из одноканальных записей. Это открытие является довольно неожиданным, поскольку С277 не участвует в формировании проводящего пути в известных трехмерных структурах. Это обеспечивает дополнительную поддержку понятия тесного взаимодействия субъединиц в определении свойств ворот и проникновения CLC-каналов.

Молекулярные детерминанты функции канала CLC

За последние 20 лет сочетание сайт-направленного мутагенеза и функционального анализа мутантных каналов позволило понять механизмы и детерминанты последовательности ворот канала CLC и проникновения анионов. Эксперименты по сайт-направленному мутагенезу на нескольких каналах CLC продемонстрировали, что один и тот же консервативный глутамат в начале спирали F, движение которого необходимо для транспорта протонов в антипортерах CLC, важен для быстрого запуска в ClC-0, ClC-1 и ClC-2. (Фальке и др., 1997; Дутцлер и др., 2003 г.; Нимейер и др., 2003; De Santiago et al., 2005) и поэтому был назван «запирающим глутаматом». В каналах ClC-K этот «запирающий глутамат» заменяется валином, поэтому часто предполагается, что ClC-Ka и ClC-Kb не имеют протопорных затворов. Тем не менее, одноканальные записи от ClC-Ka/barttin выявили короткие события стробирования и очень высокую вероятность открытия канала (Riazuddin et al., 2009; Fischer et al., 2010). Было обнаружено, что время, проведенное в открытом и закрытом состояниях, распределяется биномиально, а самый высокий наблюдаемый уровень проводимости всегда был кратным двум, демонстрируя, что наблюдаемые переходы открытия и закрытия вызваны отдельными воротами протопор без вмешательства постоянно открытых общих ворот (Riazuddin). и другие., 2009; Фишер и др., 2010). Гомологичный крысиный ClC-K1 также функционален в отсутствие бартина и, таким образом, дает возможность более подробно изучить влияние бартина на функцию ClC-K. В отсутствие бартина в rClC-K1 проявляются протопоры и общие вентильные процессы с противоположной зависимостью от напряжения. Совместная экспрессия с бартином приводит к постоянному открытию общих ворот, опять же, как показано биномиальным распределением гистограмм амплитуды для каждого состояния проводимости при совместной экспрессии с бартином (Fischer et al., 2010). Хотя результаты подразумевают, что боковые цепи, отдельные от исходного «запирающего глутамата», должны быть вовлечены в затвор протопор, точная молекулярная основа такого затвора еще не идентифицирована в каналах ClC-K.

В ClC-0, ClC-1 и ClC-2 цистеин находится рядом с интерфейсным доменом и в непосредственной близости от S ext (C212 в ClC-0, C277 в ClC-1 или C258 в ClC-2) играет решающую роль в медленном кооперативном гейтировании (Lin et al., 1999; Accardi et al., 2001; Zúñiga et al., 2004; Де Сантьяго и др., 2005 г.; Вайнбергер и др., 2012). Опять же, в каналах ClC-K отсутствует цистеин в этом положении, что позволяет предположить, что эта боковая цепь не требуется для общего управления воротами. Основываясь на трехмерных структурах CLC-антипортеров, недавно было высказано предположение, что медленное совместное запирание ClC-0 и ClC-1 зависит от остатка тирозина, который координирует центральный сайт связывания хлорида (Bennetts and Parker, 2013). Считается, что этот тирозин взаимодействует с глутаматом селектора в качестве последнего шага медленного селектора, чтобы закупорить или открыть пору.Однако до сих пор неизвестно, каким образом общие ворота одновременно передаются обеим протопорам. Неизвестно даже, находятся ли антипортеры в семействе CLC под контролем кооперативного воротного механизма. Однако на основании предыдущих исследований кажется разумным, что перегруппировка карбокси-конца может потребоваться для кооперативного гейтирования (Bykova et al., 2006; Garcia-Olivares et al., 2008; Ma et al., 2011; Stölting et al. ., 2013).

Преобразование антипортеров CLC в каналы/унипортеры

Для понимания структурных особенностей, отличающих анионный канал CLC от анион-протонного обменника, были предприняты попытки преобразовать антипортеры CLC в анионные каналы или наоборот.Однако пока эти попытки не увенчались полным успехом. Замена остатка глутамата («затворный глутамат» E148 в EcClC) в спирали F на аланин отменяет вторично-активный транспорт и делает возможным пассивное проникновение анионов (Accardi and Miller, 2004; Jayaram et al., 2008). Соответствующий обмен также устранил связь транспорта протонов с потоком хлорида в человеческих анион/протонных антипортерах ClC-4 и ClC-5 (Picollo and Pusch, 2005; Scheel et al., 2005). Другой остаток глутамата в EcClC (E203) также может быть нейтрализован заменой на аланин, чтобы нарушить связь транспорта хлоридов и протонов, что приведет к переключению на каналоподобный фенотип, возможно, из-за отсутствия внутреннего сайта связывания протонов (Accardi и другие., 2005). Некоторые замены центрального тирозина (Y445 в EcClC) также приводили к кажущемуся канальному фенотипу с сильным уменьшением наблюдаемой плотности анионов для S cen в сопутствующих рентгеновских кристаллических структурах (Accardi et al., 2006). Мутация E148 вместе с Y445 увеличивала транспорт унитарных анионов в EcClC выше значений, наблюдаемых для унипортеров, однако наблюдаемые скорости проводимости были значительно ниже соответствующих значений в каналах CLC (Jayaram et al., 2008). Следует отметить, однако, что все эти остатки в основном сохраняются даже в канальной ветви семейства CLC, что дает важную информацию о процессе проводимости анионов и протонов, но не позволяет продемонстрировать фактическую разницу между транспортерами и каналами из одного и того же семья.Сообщений о преобразовании канала CLC в антипорт пока нет.

Клеточная физиология и патофизиология каналов CLC

CLC-1

Скелетные мышцы взрослых уникальны среди возбудимых тканей благодаря высокой проводимости хлоридов в покое. Он превышает сарколеммальную калиевую проводимость более чем в четыре раза и настолько высок, что изменения внеклеточных концентраций хлоридов не изменяют потенциал покоя, а скорее приводят к изменениям внутриклеточного [Cl ] до тех пор, пока равновесный потенциал ионов хлора снова равняется потенциалу покоя мышц (Hodgkin and Horowicz, 1959; Bretag, 1987).Физиологическая роль ClC-1 стала ясна при изучении патофизиологии врожденной миотонии, редкого состояния человека, характеризующегося ригидностью мышц при резких резких движениях (Bryant and Morales-Aguilera, 1971; Adrian and Bryant, 1974). В миотонических мышечных волокнах мембранный потенциал не полностью реполяризуется после серии потенциалов действия во время произвольных сокращений, что приводит к так называемой постдеполяризации. Постдеполяризации могут приводить к длительной электрической активности мышечных волокон даже после прекращения активности нейронов и, таким образом, являются электрофизиологической основой ригидности мышц (Adrian and Bryant, 1974).Временной ход самого потенциала действия не изменяется в мышечных волокнах миотонической козы, что указывает на то, что ClC-1 не способствует реполяризации самого потенциала действия (Bryant, 1973).

Последеполяризация миотонических мышечных волокон происходит из-за накопления K + в Т-трубочках, что происходит как в нормальных, так и в миотонических мышцах во время повторяющихся потенциалов действия. В нормальных скелетных мышцах высокая проводимость хлоридов в состоянии покоя снижает константу длины сарколеммы и предотвращает распространение этой деполяризации вдоль сарколеммы.В отсутствие шунтирующей сарколеммальной хлоридной проводимости в миотонической мышце деполяризация t-трубочек приводит к деполяризации мембраны сарколеммы, вызывая устойчивую активность мышечного волокна. До сих пор ведутся споры о том, обеспечивает ли ClC-1 свою шунтирующую проводимость только через каналы, локализованные вдоль наружной сарколеммальной мембраны или также вдоль t-трубочек. Недавнее исследование представило доказательства однородного распределения в Т-трубочках и мембране сарколеммы (DiFranco et al., 2011), в то время как в другой статье описывается эксклюзивная экспрессия в поверхностной мембране (Lueck et al., 2010). Независимо от точной локализации, хлоридные каналы в мышцах позволяют волокнам скелетных мышц электрически переносить инвагинации t-тубулярной мембраны и последующее накопление калия (Рисунки).

ClC-1 является основным хлоридным каналом в мышцах. (A) В скелетных мышцах мембранный потенциал покоя определяется градиентом калия через сарколеммальную и Т-трубчатую мембраны.Потенциалы действия приводят к открытию кальциевых каналов L-типа (DHPR), которые, в свою очередь, открывают внутриклеточные каналы (RyR), высвобождающие кальций из саркоплазматического ретикулума, необходимый для сокращения мышцы. (B) Последовательность потенциалов действия приводит к перемещению калия через каналы во внеклеточную сторону. Поскольку диффузия ионов из Т-трубочек идет медленно, калий накапливается и вызывает временные изменения калиевого реверсивного потенциала, которые, однако, компенсируются высокой проводимостью сарколеммального хлорида. (C) В мышечных волокнах, экспрессирующих дисфункциональные каналы ClC-1, деполяризация t-трубочек распространяется на поверхностную мембрану и может запускать спонтанную генерацию новых потенциалов действия даже после окончания произвольного движения. Эта «последеполяризация» отмечена красным. (D) Репрезентативные записи мутантных каналов ClC-1, несущих болезнетворные мутации, иллюстрирующие разнообразные результаты замены отдельных аминокислот при гейтировании ClC-1.

ClC-1 был клонирован из скелетных мышц как первый член семейства CLC млекопитающих (Steinmeyer et al., 1991). Мутации в CLCN1 как генетическая основа врожденной миотонии доказали, что ClC-1 действительно представляет собой хлоридный канал взрослых скелетных мышц (Koch et al., 1992; George et al., 1993). ClC-1 демонстрирует внутреннюю проводимость унитарного тока при симметричных концентрациях хлоридов со значением примерно на 1,5 пСм ниже -85 мВ и в 10 раз более низкую проводимость при напряжениях, положительных по отношению к потенциалу обращения хлоридов (Pusch et al., 1994; Stölting et al. др., 2014). ClC-1 имеет открытую вероятность 0.38 при -85 мВ (Weinberger et al., 2012) и минимально открывается только во время подъема потенциала действия, что быстрее, чем время активации ClC-1 (Fahlke and Rüdel, 1995; Accardi and Pusch, 2000; Hebeisen). и Фальке, 2005). Эти специфические свойства анионной проводимости и гейтирования делают ClC-1 идеально подходящим для обеспечения большой проводимости хлорида в состоянии покоя с минимальным вмешательством в потенциал действия. Эти свойства сводят к минимуму приток Na + во время потенциала действия и, таким образом, снижают потребление АТФ после продолжительной мышечной активности, которая необходима для активной экструзии Na + с помощью Na + /K + -АТФазы.

Хотя потенциал-зависимое гейтирование ClC-1 не является строго необходимым для его физиологической функции, почти все болезнетворные мутации, которые были изучены, нарушают гейтирование канала [за заметным исключением G230E, который влияет на проникновение ионов и селективность ClC-1 (Фальке и др., 1997)]. Первая мутация миотонии, которая была функционально проанализирована, D136G (рис. 1), связывает открытие канала с внутриклеточной концентрацией хлорида и, таким образом, инвертирует зависимость ClC-1 от напряжения (Fahlke et al., 1995). D136G hClC-1 открывается только при напряжении ниже равновесного потенциала хлорида. Отток хлоридов при таких напряжениях будет снижать внутриклеточную концентрацию хлоридов до достижения потенциала реверсии хлоридов, подобного потенциалу покоя сарколеммы. При этом [Cl ] D136G hClC-1 будет постоянно закрыт, что полностью согласуется с низкой проводимостью хлоридов в покое и повышенной возбудимостью. D136G hClC-1 напоминает ClC-2 по многим свойствам и, таким образом, иллюстрирует важность специфичной для изоформ специализации внутри семейства CLC.Впоследствии было идентифицировано несколько мутаций, которые сместили кривую активации ClC-1 в сторону более деполяризованных потенциалов (Pusch et al., 1995; Rhodes et al., 1999; Wu et al., 2002) (рис. 1). Такие сдвиги уменьшают открытую вероятность hClC-1 при -85 мВ и, таким образом, снижают проводимость хлорида в покое. Сходное изменение ворот канала лежит в основе миотонии у коз (Beck et al., 1996). Другие мутации приводят к изменениям ворот, так что два процесса ворот развивают противоположный паттерн зависимости от напряжения, один стимулируется деполяризацией мембраны, а другой гиперполяризацией, как в каналах T550M ClC-1 (Warnstedt et al., 2002; Ву и др., 2002; Вайнбергер и др., 2012). За последние два десятилетия у пациентов с врожденной миотонией было обнаружено большое разнообразие болезнетворных мутаций. Эти мутации распространены по всей кодирующей области ClC-1, и их функциональный анализ дал много важных сведений о последовательностях, определяющих функцию канала CLC (Fahlke et al., 1995, 1997; Wollnik et al., 1997; Saviane et al. ., 1999; Richman et al., 2012; Weinberger et al., 2012; Lee et al., 2013).

Недавно новый вариант ClC-1 был идентифицирован экзономическим секвенированием у пациентов, страдающих идиопатической эпилепсией (Chen et al., 2013). Это исследование также показало транскрипты мРНК ClC-1 и белковые полосы, окрашенные антителами против ClC-1 в частях головного мозга человека. Эта новая роль и локализация ClC-1 может привести к новым перспективам физиологии каналов CLC в центральной нервной системе. Однако отсутствие центральных неврологических симптомов у пациентов с врожденной миотонией или у животных, моделирующих это заболевание, поднимает вопрос о том, как функциональные изменения ClC-1 могут способствовать развитию эпилепсии.

CLC-2

ClC-2 был обнаружен вскоре после ClC-1 как в возбудимых, так и в невозбудимых клетках (Thiemann et al., 1992). ClC-2 демонстрирует независимую от напряжения проводимость одного канала всего ~ 2,4 пСм на протопору (Stölting et al., 2013). Он закрывается при положительных потенциалах и активируется в течение очень медленного времени при гиперполяризации. После активации при отрицательных потенциалах напряжение возвращается к положительным потенциалам, что приводит к очень медленной деактивации тока. В то время как протопорные ворота полностью закрываются при положительных потенциалах, медленные общие ворота демонстрируют минимальную вероятность открытия значительно выше нуля (De Santiago et al., 2005; Гарсия-Оливарес и др., 2008). Сходные особенности гейтирования наблюдались в ооцитах Xenopus и в клетках млекопитающих, однако кинетика активации и деактивации была значительно медленнее в ооцитах. Кинетика гейтирования модифицируется связыванием нуклеотидов с карбокси-концом (Dhani et al., 2008; Stölting et al., 2013) и составом окружающих липидов (Hinzpeter et al., 2007). Также было обнаружено, что активация и деактивация ClC-2 значительно ускоряются делециями или модификациями карбокси- или амино-концевых доменов, что предполагает участие больших перестроек этих белковых доменов (Garcia-Olivares et al., 2008; Сен-Мартен и др., 2009 г.; Stölting et al., 2013), например, для ClC-0 и ClC-1 (Быкова и др., 2006; Ma et al., 2011).

Запирание ClC-2 зависит от внутриклеточного [Cl ], так что открытие канала происходит только при потенциалах, отрицательных по отношению к равновесному потенциалу Cl (Niemeyer et al., 2004). В клетках, в которых мембранный потенциал ограничен каналами различной селективности в сторону более отрицательных потенциалов, можно предположить, что ClC-2 будет оставаться открытым и обеспечивать отток анионов до тех пор, пока равновесный потенциал хлоридов не сравняется с мембранным потенциалом.Таким образом, ClC-2 может способствовать регуляции внутриклеточных концентраций анионов в нейронах, глии или оттоку хлоридов в эпителиальных клетках. Ранние исследования ClC-2, гетерологически экспрессируемого в ооцитах Xenopus , выявили активацию с помощью осмотических градиентов, подтверждая, что ClC-2 может быть вовлечен в клеточный осмотический гомеостаз (Gründer et al., 1992). Однако функциональные свойства ClC-2 явно отличаются от активируемых объемом анионных каналов (Nilius et al., 1997), а клетки, лишенные ClC-2, демонстрируют неизмененные активируемые объемом анионные потоки (Nehrke et al., 2002).

ClC-2 может собираться с дополнительными субъединицами, которые не требуются для функции ClC-2, а скорее определяют субклеточную локализацию и модифицируют селекцию канала в различных типах клеток. Первой описанной вспомогательной субъединицей ClC-2 был белок cereblon, который связывается с карбокси-концом ClC-2 и предположительно регулирует экспрессию функциональных каналов в сетчатке (Hohberger and Enz, 2009). Совсем недавно было показано, что новая субъединица под названием GlialCAM (синоним более раннего обозначения HepaCAM) связана с ClC-2 (Jeworutzki et al., 2012). GlialCAM представляет собой белок длиной 416 аминокислот с одним трансмембранным доменом и большим Ig-подобным аминоконцевым доменом V- и C2-типа. В гетерологичных системах экспрессии совместная экспрессия GlialCAM с ClC-2 переключала фенотип в сторону почти конститутивно открытого канала. Хотя GlialCAM взаимодействует только с ClC-2 in vivo из-за его специфичной для клеток экспрессии, было обнаружено, что он связывается с несколькими каналами CLC in vitro , такими как ClC-0, ClC-1 и ClC-K/barttin влияющие на локализацию и общие параметры ворот (Jeworutzki et al., 2014).

Токи ClC-2, записанные на срезах головного мозга животных, нокаутированных по GlialCAM, не сильно отличаются от соответствующих следов, полученных у животных дикого типа, что позволяет предположить, что GlialCAM не оказывает такого резкого эффекта на вход канала в нативных клетках, как в гетерологичной системе экспрессии ( Hoegg-Beiler и др., 2014). Работа над мышами с нокаутом MLC1 также показала, что MLC1, мембранный белок с неизвестной функцией, ассоциированный с мегалэнцефальной лейкоэнцефалопатией (Leegwater et al., 2001), может стабилизировать GlialCAM в плазматической мембране и, таким образом, действовать как дополнительный партнер по связыванию в комплексе ClC-2/GlialCAM (Hoegg-Beiler et al., 2014).

Среди наиболее понятных функций ClC-2 является отток хлоридов через базолатеральную мембрану в желудочно-кишечный тракт, облегчающий реабсорбцию NaCl и впоследствии H 2 O (рис. ) (Catalán et al., 2002, 2004). Предполагаемый активатор ClC-2, лубипростон, улучшает течение хронического идиопатического запора, вероятно, за счет стимуляции секреции хлоридов и воды в просвет толстой кишки.Успех этого лечения согласуется с ролью ClC-2 также в апикальной секреции хлоридов (Cuppoletti et al., 2004). Во время разработки ClC-2 сильно экспрессируется в легочной ткани и был предложен в качестве потенциального пути для замены отсутствующей проводимости хлоридов у пациентов, страдающих муковисцидозом (Schwiebert et al., 1998, -2). Однако мыши Clcn 2 -/- не страдают легочными заболеваниями, а дополнительный нокаут ClC-2 у мышей CFTR -/- не ухудшил фенотип муковисцидоза у этих животных (Zdebik et al. др., 2004). Исследования мышей с нокаутом также выявили дегенерацию яичек и дегенерацию сетчатки, что подчеркивает роль ClC-2 в пигментном эпителии сетчатки и в клетках Сертоли, где этот канал может участвовать в регуляции высокоспециализированной секреции жидкости этими тканями (Bösl et al. ., 2001). Хотя это и не связано с каким-либо почечным заболеванием, экспрессия ClC-2 также была обнаружена в почках (Thiemann et al., 1992). Анализ транскриптов мРНК выявил значительную экспрессию во всех сегментах нефрона, за исключением кортикального собирательного протока и наружного мозгового вещества собирательного протока, и было обнаружено, что он модулируется альдостероном у крыс (Ornellas et al., 2002). Было также показано, что ClC-2 экспрессируется в скелетных мышцах (Thiemann et al., 1992). Однако токи ClC-2 не могли быть зарегистрированы ни в почках, ни в скелетных мышцах. Вполне возможно, что ClC-2 может образовывать гетеродимеры в этих тканях, где экспрессируются другие каналы CLC, такие как ClC-1 (Lorenz et al., 1996; Stölting et al., 2014) или каналы ClC-K.

ClC-2 экспрессируется в эпителии, а также в возбудимых клетках. (A) В энтероцитах толстой кишки хлорид абсорбируется со стороны просвета через хлоридно-бикарбонатный обменник, а затем транспортируется через базолатеральный ClC-2 в интерстиций.Натрий следует через просветный канал или натрий/протонный обменник и транспортируется в интерстиций с помощью Na + /K + АТФазы (Catalán et al., 2002). (B) Роль ClC-2 в возбудимых клетках, таких как нейроны, все еще обсуждается. Вероятный механизм оставляет ClC-2 закрытым при эквивалентном калиевом мембранном потенциале покоя, но изменения потенциала реверсии хлоридов за счет притока Cl открывают ClC-2 и обеспечивают отток хлоридов через этот канал.Отток хлоридов, возможно, вызывает деполяризацию мембран и повышенную возбудимость. (C) Одноканальные записи мутантных каналов ClC-2 с мутациями, обнаруженными у пациентов с идиопатической эпилепсией. Эти мутации сокращают длительные закрытые состояния, вызванные закрытием общих ворот. (D) График вероятности нахождения канала ClC-2 в закрытом состоянии в течение указанного времени демонстрирует ассоциированные с заболеванием изменения общего. (E) W570X, недавно обнаруженный у пациентов с идиопатической генерализованной эпилепсией, вызывает такое же ускорение активации и деактивации ClC-2, как и ранее изученный мутант H573X, при экспрессии в клетках HEK293. (F) H573X частично открывает медленные ворота ClC-2. (C,D) были воспроизведены и изменены из Stölting et al. (2013). Данные H573X ClC-2 были воспроизведены и изменены из Garcia-Olivares et al. (2008).

ClC-2 экспрессируется в нейрональных и глиальных клетках (Staley, 1994; Nobile et al., 2000; Sìk et al., 2000), но его роль в центральной нервной системе еще недостаточно изучена. Мутации в гене CLCN2 были обнаружены у пациентов с идиопатической генерализованной эпилепсией, а также при лейкоэнцефалопатии (D’Agostino et al., 2004; Клефус-Ли и др., 2009 г.; Сен-Мартен и др., 2009 г.; Классен и др., 2011; Депьен и др., 2013; Штёльтинг и др., 2013). Мутации потери функции CLCN2 приводят к вакуолизации миелина в головном и спинном мозге и к легким неврологическим нарушениям, таким как мозжечковая атаксия (Depienne et al., 2013). Отсутствие ClC-2 вызывает аналогичные патологические изменения у пациентов-людей, наблюдаемые у мышей Clcn 2 -/- . Сходные изменения в морфологии мозга вызываются потерей GlialCam и MLC1, скорее всего, потому, что эти белки собираются в белковый комплекс, препятствующий образованию таких вакуолей.

Clcn 2 -/- мыши демонстрируют аномальную корковую активность и более высокую восприимчивость к индуцированным припадкам, но не проявляют явных признаков эпилептических припадков у животных (Blanz et al., 2007; Cortez et al., 2010). Изменения в динамической регуляции внутринейрональной концентрации хлоридов могут лежать в основе этой повышенной возбудимости (Blanz et al., 2007; Földy et al., 2010). Активация рецепторов GABA A гиперполяризует нейроны за счет временного притока хлоридов.ClC-2 может активироваться в результате увеличения внутриклеточного [Cl ] и обеспечивать путь выхода ионов хлорида (рис. 1). Этот механизм был впервые продемонстрирован в экспериментах, в которых ClC-2 экспрессировался в ганглиозных клетках задних корешков. Этот маневр уменьшил [Cl ] int и инвертировал деполяризующие токи в гиперполяризующие ГАМК (Staley et al., 1996). Другой возможный механизм постулирует, что каналы ClC-2 могут оставаться открытыми при положительном напряжении и обеспечивать реполяризующий приток хлорида (Ratté and Prescott, 2011).

Несколько миссенс-мутаций CLCN2 , обнаруженных у пациентов, страдающих идиопатической эпилепсией, изменяют гейтирование ClC-2 сходным образом (рисунки ), т. е. более быстрое время активации и деактивации. Это однородное функциональное последствие поддерживает представление о том, что эти изменения в закрытии каналов могут способствовать патогенезу эпилепсии. У мутанта ClC-2 отток хлорида после повторной стимуляции ГАМК будет активироваться быстрее и, таким образом, проводить деполяризующий ток с более быстрым началом, чем каналы дикого типа.Причинная роль мутаций CLCN2 в прошлом подвергалась сомнению несколькими авторами (Niemeyer et al., 2010; Depienne et al., 2013; Jentsch, 2013). Одним из аргументов было то, что эти мутации не связаны с эпилепсией в менделевском стиле. Некоторые из этих вариаций последовательности обнаруживают неполную косегрегацию и встречаются не только у пораженных, но и у здоровых особей одной и той же семьи. Однако такой тип наследования не является редкостью при идиопатической генерализованной эпилепсии. Появляется все больше доказательств того, что это заболевание возникает не просто из-за возникновения отдельных болезнетворных мутаций, а скорее является результатом сосуществования множественных вариаций последовательностей, влияющих на разные гены (Klassen et al., 2011). Проявление и тяжесть заболевания зависят от комбинированных функциональных последствий множественных совпадающих генетических факторов риска, способствующих повышенной возбудимости центральной нервной системы. Модель полигенной гетерогенности предполагает, что мутации CLCN2 и влияют на возбудимость нейронов, но эти изменения приводят только к эпилепсии вместе с мутациями в других генах (Klassen et al., 2011).

Одна из мутаций, связанных с идиопатической эпилепсией, W570X, также была идентифицирована в исследовании секвенирования генома пациентов с лейкоэнцефалопатией (Depienne et al., 2013). Эта мутация очень похожа на укорочение ClC-2, изученное ранее в нашей лаборатории, и вызывает сильное ускорение активации и инактивации ворот с почти постоянно открытыми медленными воротами (Рисунки) (Garcia-Olivares et al., 2008). Однако у пациента, страдающего лейкоэнцефалопатией, не было судорог, предположительно из-за почти полной деградации усеченного мутантного канала (Depienne et al., 2013).

CLC-Ka/CLC-Kb

ClC-Ka и ClC-Kb экспрессируются исключительно в нефроне и сосудистой полоске внутреннего уха (рис. ).Физиологическая роль этих белков была выяснена после появления мыши Clcnk 1 -/- (ClC-K1 является гомологом ClC-Ka для грызунов) с выраженным несахарным диабетом и сцеплением CLCNKB с Синдром Барттера, состояние человека, характеризующееся нарушением концентрации почечной мочи, что приводит к гипотензии с повышенными уровнями ренина и альдостерона (Simon et al., 1997; Matsuura et al., 1999). Эти данные свидетельствуют о том, что ClC-Ka и ClC-Kb имеют решающее значение для нормальной концентрации мочи.

ClC-K каналы необходимы для трансэпителиального транспорта растворенных веществ в петле Генле и сосудистой полоске внутреннего уха. (A) Экспрессия ClC-Ka/barttin и ClC-Kb/barttin в тонкой восходящей и толстой восходящей части петли Генле. Хлорид абсорбируется на просветной стороне либо за счет вторично-активного транспортного механизма, либо путем диффузии через апикальные каналы, а затем проводится через ClC-Ka/барттин или ClC-Kb/барттин к интерстициальной стороне. ClC-Ka/barttin необходим для пассивной реабсорбции NaCl в тонких восходящих ветвях.В толстой восходящей части ClC-Kb/barttin поддерживает базолатеральный отток хлоридов, необходимый для электрогенной абсорбции NaCl. Поглощение NaCl устанавливает трансэпителиальный потенциал, который дополнительно управляет парацеллюлярным потоком Mg 2+ или Ca 2+ . (B) ClC-Ka/barttin и ClC-Kb/barttin опосредуют базолатеральный отток хлоридов и поддерживают зарядку эндолимфы посредством секреции K + в сосудистой полоске. (C) Считается, что Барттин связывается со спиралью B (пурпурный) и J (синий) каналов ClC-K (Tajima et al., 2007). (D) Конфокальные флуоресцентные изображения (любезно предоставленные доктором Даниэлем Войцеховски) только YFP-ClC-Ka показывают преимущественное окрашивание внутриклеточных мембран (слева). При совместной экспрессии CFP-barttin ClC-Ka перемещается на плазматическую мембрану (правая сторона). (E) Барттин переключает ClC-Ka и ClC-Kb в активное состояние, как видно на нормализованном графике зависимости тока от напряжения. (F) Барттин увеличивает комплексное гликозилирование (#) и стабильность комплекса ClC-K/барттин в плазматической мембране. (A,B) изменены после Fahlke and Fischer (2010).

Первоначальные попытки охарактеризовать функцию этих каналов не увенчались успехом (Kieferle et al., 1994), поскольку ClC-Ka и Kb могут функционально экспрессироваться только вместе с дополнительной субъединицей бартина (Estévez et al., 2001; Waldegger et al., 2002; Шолль и др., 2006). Барттин был клонирован как продукт гена болезни синдрома Барттера 4 типа, сочетающего выраженные почечные симптомы других синдромов Барттера с нейросенсорной глухотой (Birkenhäger et al., 2001). Это белок из 320 аминокислот, который содержит два предполагаемых трансмембранных домена, за которыми следует длинный карбокси-конец. Укорочения barttin после положения 72 практически не затрагивают функцию ClC-K/barttin каналов в гетерологичных системах экспрессии (Scholl et al., 2006; Janssen et al., 2009). Предполагается, что взаимодействие Барттина с каналами ClC-K происходит вдоль двух трансмембранных спиралей B и J, но дополнительные подробности о взаимодействии канала и вспомогательной субъединицы все еще отсутствуют (рис. ) (Tajima et al., 2007).

У мышей и крыс ClC-K1, ClC-K2 и барттин распределяются, начиная с тонкого и заканчивая толстым восходящим протоком петли Генле и заканчивая собирательным протоком (Vandewalle et al., 1997; Waldegger et al. , 2002; Ниссан и др., 2004). Две изоформы ClC-K, однако, демонстрируют различия в их экспрессии в разных частях нефрона, так что в настоящее время считается, что каналы, состоящие из ClC-Ka и бартина, опосредуют прохождение Cl через эпителий преимущественно в тонком восходящем эпителии. конечности, в то время как ClC-Kb/barttin, как полагают, необходим для обратного захвата хлоридов в толстой восходящей конечности и поддержания трансэпителиального потенциала, который приводит к парацеллюлярной абсорбции различных катионов, включая Ca 2+ и Mg 2+ .ClC-K и barttin также проявляют обильную экспрессию в сосудистой полоске внутреннего уха. Каналы ClC-K/barttin обеспечивают базолатеральный отток ионов Cl , накопленных котранспортером NKCC1 Na + -K + -Cl , что необходимо для генерации эндокохлеарного потенциала.

Ни экспрессия ClC-Ka, ни ClC-Kb не приводят к видимым токам при отсутствии субъединицы бартина. Барттин выполняет несколько функций на каналах ClC-K.Он поддерживает выход из эндоплазматического ретикулума, стимулирует вставку и нарушает удаление ClC-Ks из поверхностной мембраны (рис. 1) (Scholl et al., 2006). Более того, барттин повышает стабильность белка ClC-K за счет стимуляции комплексного гликозилирования (Рисунки) (Hayama et al., 2003; Scholl et al., 2006; Janssen et al., 2009). ClC-Ka и ClC-Kb не функционируют без вспомогательной субъединицы и переключаются в проводящее состояние за счет ассоциации с бартином. При совместной экспрессии ClC-Ka и ClC-Kb проявляют независимые от времени, в основном не выпрямляющие токи (Janssen et al., 2009; Фишер и др., 2010). Каналы ClC-Ka/барттина постоянно открыты при положительном напряжении до -150 мВ. Спад вероятности размыкания при отрицательном напряжении до -150 мВ приводит к характерному «крючку» на макроскопических графиках вольт-амперной характеристики. Одноканальная проводимость ClC-Ka составляет примерно 30 пСм и, таким образом, значительно больше, чем у других каналов CLC (рис. 1). До сих пор не определены унитарные свойства ClC-Kb.

Несколько миссенс-мутаций CLCNKB были обнаружены у пациентов с синдромом Барттера (Simon et al., 1997; Фукуяма и др., 2004). Эти мутации обычно вызывают потерю функции канала и, таким образом, ожидается, что они уменьшат реабсорбцию воды, влияя на кортико-медуллярный осмотический градиент. Имеется одно сообщение о пациенте с комбинированными мутациями в CLCNKA и CLCNKB . Как и ожидалось, пациент страдает тяжелой формой почечной недостаточности и нейросенсорной глухотой, которые очень похожи на мутации в гене BSND , которые также влияют на оба хлоридных канала одновременно (Schlingmann et al., 2004). Одна мутация, предсказывающая T481S ClC-Kb, была обнаружена при генетическом скрининге когорт гипертоников. В гетерологичных системах экспрессии это позволяет открывать каналы ClC-Kb даже в отсутствие бартина (Jeck et al., 2004; Sile et al., 2009). Мутация может увеличить реабсорбцию соли и, следовательно, воды и, таким образом, повысить системное кровяное давление. Более того, увеличение токов хлора в сосудистых полосках увеличивает эндокохлеарный потенциал и тем самым снижает порог слышимости (Frey et al., 2006). Поскольку уменьшение объема крови за счет увеличения экскреции воды может усилить секрецию ренина и активировать ренин-ангиотензин-альдостероновую систему (РААС), потеря функции ClC-K/бартиновых каналов может увеличить риск сердечной недостаточности. Недавно сообщалось, что вариант CLCNKA , предсказывающий R83G ClC-Ka, приводит к потере функции этого канала и был предложен как фактор риска сердечной недостаточности (Cappola et al., 2011). Другие встречающиеся в природе варианты ClC-Ka, которые повышают системное кровяное давление после увеличения нагрузки NaCl, были связаны с хронической солевой гипертензией (Barlassina et al., 2007).

Важная роль ClC-K/бартиновых каналов в регуляции содержания соли и воды в организме делает эти каналы важной мишенью для фармакологического вмешательства (Picollo et al., 2004; Liantonio et al., 2006, 2012; Imbrici et al. др., 2014). Активаторы ClC-K/barttin могут корректировать потерю функции каналов, несущих естественные мутации, связанные с синдромом Барттера или идиопатической глухотой. Блокаторы ClC-K/каналов бартина могут служить диуретиками или антигипертензивными препаратами.Однако существуют потенциальные побочные эффекты, которые следует тщательно изучить. Слух оказывается гораздо более чувствительным к активности ClC-K каналов (Riazuddin et al., 2009), чем функция почек. Хотя гемато-лабиринтный барьер защищает эпителий внутреннего уха от общего кровообращения (Juhn and Rybak, 1981), некоторые соединения, такие как салицилат, фуросемид или аминогликозидные антибиотики, легко влияют на функцию внутреннего уха. Кроме того, длительное наблюдение за пациентами, страдающими синдромом Барттера, выявило стойкую гиперренинемию, вторичный гиперальдостеронизм и развитие протеинурии у многих пациентов, даже если другие симптомы достаточно хорошо контролировались (Bettinelli et al., 2007). Поэтому возможные побочные эффекты фармакологических изменений в функции ClC-K должны быть тщательно проверены и могут даже препятствовать широкому клиническому использованию.

Миссенс-мутации, препятствующие экспрессии barttin, приводят к очень тяжелому почечному фенотипу (Janssen et al., 2009; Fahlke and Fischer, 2010; Nomura et al., 2011), часто с терминальной стадией почечной недостаточности в молодом возрасте. Поскольку др. мутации BSND , которые также отменяют образование функционального ClC-K/barttin, действительно сохраняют почечную функцию, возникает соблазн предположить, выполняют ли эти каналы дополнительные функции в почечных клетках.Успешное лечение этих редких случаев может потребовать лучшего понимания взаимодействия ClC-K с субъединицей barttin. Однако в настоящее время неясно, как барттин взаимодействует с каналами ClC-K, а также неясно, может ли это взаимодействие быть нацелено на изменение функции канала.

Outlook

Анионные каналы существуют во всех клетках человеческого тела и выполняют множество физиологических функций. Важность этих каналов подчеркивается генетическими вариантами, связанными с основными заболеваниями.Эволюция привела к множеству семейств анионтранспортных белков с очень разными функциями и физиологическими ролями. Семейство CLC в настоящее время является крупнейшим известным семейством генов, кодирующих анионные каналы и транспортеры, и многие аспекты функции CLC-каналов уже хорошо изучены. Функцию канала CLC изучали с помощью записи патч-клэмпа целых клеток и одного канала и флуоресцентной визуализации. Трехмерные структуры родственных белков позволили получить детальное представление о молекулярной архитектуре этих белков.Используя модели животных с нокаутом и нокаутом, мы можем изучать влияние функций CLC на клеточные процессы.

CLC-каналы функционально сильно отличаются от потенциалзависимых катионных каналов, и многие из этих особых свойств обусловлены их эволюцией от транспортеров. Многие вторично-активные транспортеры могут принимать режимы проскальзывания, подобные каналам (DeFelice and Goswami, 2007). Однако в семействе CLC претерпело довольно строгое разделение этих мод на антипортеры и каналы без транспортной активности.Молекулярные детерминанты этой дифференциации не ясны. В то время как замена одной аминокислоты (D136G) может преобразовать один канал, ClC-1, в канал со свойствами, очень похожими на ClC-2, еще не удалось преобразовать канал CLC в переносчик CLC. Каналы CLC привлекли большое внимание благодаря своей уникальной двуствольной конструкции. Мы до сих пор не понимаем молекулярных функций и физиологического воздействия этой любопытной конструкции. Как эти две субъединицы взаимодействуют друг с другом и каково физиологическое преимущество наличия двух более или менее синхронизированных пор?

Недавно предсказанная локализация ClC-1 в центральной нервной системе поднимает вопросы относительно потенциальной роли этого канала в этой системе органов.До сих пор неясно, как ClC-2 предотвращает нейродегенерацию и какую роль мутантный ClC-2 играет в повышенной возбудимости центральной нервной системы. ClC-Ka и -Kb являются важными фармакологическими мишенями, однако ни одно соединение, нацеленное на эти каналы, еще не вошло в клиническую практику. Возможное образование гетеродимерных каналов CLC со свойствами, сильно отличающимися от свойств гомодимерных каналов, также требует дальнейшего изучения. Хотя существует много знаний о хлоридной проводимости каналов CLC, возможно, стоит также изучить проникновение бикарбоната.Нам также не хватает полного молекулярного понимания того, как вспомогательные субъединицы, такие как barttin или GlialCAM, модифицируют CLC-каналы.

Изучение семейства CLC всегда было обусловлено как интересом к биофизическим свойствам, так и их физиологической значимостью. Последние 25 лет предоставили знания и инструменты для решения многих остающихся вопросов. Мы надеемся, что эта работа приведет к детальному пониманию молекулярной физиологии и патофизиологии этих каналов и может улучшить качество жизни многих пациентов с редкими или распространенными заболеваниями.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Функция и дисфункция CLC-каналов в норме и при патологии

Abstract

CLC-каналы и транспортеры экспрессируются в большинстве тканей и выполняют разнообразные функции. Существует четыре канала CLC человека, ClC-1, ClC-2, ClC-Ka и ClC-Kb, и пять транспортеров CLC, от ClC-3 до -7.Некоторые из каналов CLC дополнительно связаны с дополнительными субъединицами. В то время как barttin является обязательным для функциональной экспрессии ClC-K, GlialCam является факультативной субъединицей ClC-2, которая модифицирует гейтирование и, таким образом, увеличивает функциональную вариабельность внутри семейства CLC. Специфичные для изоформ ионная проводимость и свойства ворот оптимизируют отдельные каналы CLC для их клеточных задач. ClC-1 предпочтительно проводит при отрицательном напряжении, и получающееся в результате выпрямление внутрь обеспечивает большую проводимость хлорида в состоянии покоя без вмешательства в потенциал действия мышцы.Эксклюзивное открытие при напряжениях, отрицательных по отношению к потенциалу реверсии хлоридов, позволяет ClC-2 регулировать внутриклеточные концентрации хлоридов. ClC-Ka и ClC-Kb в равной степени подходят для входящих и исходящих токов для поддержки трансцеллюлярных потоков хлоридов. Каждый ген канала CLC человека был связан с генетическим заболеванием, и изучение этих мутаций предоставило много информации о физиологических ролях и молекулярных основах функции канала CLC. Мутации в гене, кодирующем ClC-1, вызывают врожденную миотонию, заболевание, характеризующееся повышенной возбудимостью сарколеммы и ригидностью мышц.Потеря функции каналов ClC-Kb/барттина ухудшает резорбцию NaCl в колене Генле и вызывает гипонатриемию, гиповолемию и гипотензию у пациентов, страдающих синдромом Барттера. Мутации CLCN2 были обнаружены у пациентов с расстройствами ЦНС, но функциональная роль этой изоформы до сих пор не выяснена. Недавние связи между ClC-1 и эпилепсией и ClC-Ka и сердечной недостаточностью предполагают новые клеточные функции этих белков. Этот обзор направлен на обзор знаний о физиологических и патофизиологических функциях каналов CLC человека в свете недавних открытий биофизических, физиологических и генетических исследований.

Ключевые слова:

Ключевые слова: канал CLC, анионный канал, патч-кламп, врожденная миотония, синдром Барттера, лейкенцефалопатия (1990) установили семейство CLC белков-транспортеров анионов (рис. 1). Семейство CLC включает девять белков CLC человека, от ClC-1 до -7, а также белки ClC-Ka и -Kb. Одноканальные записи на ClC-0 выявили унитарную проводимость около 10 пСм (Miller, 1982), и, поскольку это значение предсказывает скорость транспорта, намного превышающую максимальные скорости переносчиков и насосов, почти не оставалось сомнений в том, что этот белок опосредует диффузию анионов через мембрану. водные проводящие пути.Унитарные амплитуды тока ClC-1 и ClC-2 подтверждали эту идею (Pusch et al., 1994; Weinreich, Jentsch, 2001), так что изначально предполагалось, что все члены семейства представляют собой анионные каналы. Таким образом, стало неожиданностью, когда было показано, что бактериальный гомолог E. coli функционирует как сопряженный анион/протонный обменник (Accardi and Miller, 2004). Последовательный анализ транспортных механизмов изоформ CLC человека показал, что пять из девяти CLC человека, от ClC-3 до ClC-7, представляют собой анион-протонные обменники, а не анионные каналы (Picollo and Pusch, 2005; Scheel et al., 2005; Neagoe и др., 2010; Лейл и др., 2011; Гусман и др., 2013). Таким образом, семейство CLC объединяет две функциональные группы с термодинамически разными транспортными процессами. Все экспериментальные данные, представленные до сих пор, подтверждают близкое структурное сходство членов семейства CLC и демонстрируют, что транспортные белки схожей структуры могут специализироваться в ионных каналах или транспортерах.

Семейство транспортных белков CLC включает хлоридные каналы и обменники хлорид/протон.(A) Филограмма демонстрирует раннее разделение белков CLC человека на одну ветвь хлоридных каналов, охватывающую ClC-1, ClC-2, ClC-Ka и ClC-Kb. Антипортеры хлорида / протона включают ClC-3 до -7. Каналам ClC-K требуется субъединица barttin, в то время как ClC-7 зависит от присутствия Ostm1 для нормального функционирования. Недавно GlialCAM был идентифицирован как дополнительная субъединица ClC-2. (B) Вид димера cmClC [идентификатор PDB: 3ORG (Feng et al., 2010)] в виде ленты.Одна субъединица показана светло-серым, а другая субъединица показана цветом от начала B-спирали синим до карбоксиконца красным. Верхняя часть белка включает трансмембранное ядро, а нижняя красная часть содержит карбоксиконцы с доменами CBS. (C) Более близкий вид некоторых критических остатков, координирующих ионы хлорида в ecClC (идентификатор PDB: 1OTS). Остатки Y445 и S107, окрашенные в пурпурный цвет, отвечают за связывание хлорида (зеленая сфера) в S cen , а также предполагается, что они имеют решающее значение для медленного открытия каналов CLC.E148 представляет собой так называемый «запирающий глутамат», колеблющийся от S cen до S ext , и считается, что он активно участвует в быстром включении протопор каналов CLC.

CLC-каналы и транспортеры выполняют различные физиологические задачи. В то время как CLC-обменники в основном экспрессируются во внутриклеточных компартментах, таких как эндосомы или лизосомы, и, по-видимому, вносят вклад в регуляцию «домашнего хозяйства» этих органелл, CLC-каналы расположены в поверхностной мембране возбудимых и эпителиальных клеток и способствуют регуляции возбудимости мембраны, а также транспорт электролитов, воды и питательных веществ.В этом обзоре мы сосредоточимся исключительно на канальной ветви семейства CLC, резюмируя их функции, их клеточные роли и возможное участие в заболеваниях.

Молекулярная физиология каналов CLC

Структурные детерминанты функции канала CLC

До сих пор не сообщалось о трехмерной структуре высокого разрешения для канала CLC. Однако анион/протонные обменники CLC были кристаллизованы из нескольких прокариотических и эукариотических видов (Dutzler et al., 2002; Аккарди и др., 2006 г.; Лобет и Дутцлер, 2006 г.; Фэн и др., 2010; Робертсон и др., 2010 г.; Джаярам и др., 2011 г.; Лим и др., 2012). Поскольку структурные свойства транспортеров CLC хорошо передаются для исследований структурно-функциональных функций, выполненных на каналах CLC (Miller, 2003), обычно предполагается, что каналы CLC структурно очень похожи на транспортеры CLC.

Все белки CLC собраны в виде димеров, причем каждая субъединица имеет 18 трансмембранных спиралей (обозначенных от A до R), за которыми следует цитозольный карбоксиконец, содержащий два консервативных домена цистатионин-ß-синтазы (CBS) в эукариотических CLC (Bateman, 1997). ) (Фигура ).Каждая субъединица связывает анионы без участия других субъединиц — в полном согласии с двумя отдельными активными центрами, которые транспортируют анионы независимо в двух соседних субъединицах. Эта своеобразная архитектура уже была предложена на основе ранних одноканальных записей, которые демонстрировали два равноотстоящих состояния проводимости и предполагали существование двух путей ионной проводимости, так называемых протопор, для каждого отдельного канала CLC (Miller, 1982; Miller and White, 1984). ). Три отдельных сайта связывания хлоридов внутри каждой субъединицы были идентифицированы в трехмерных структурах, S int , S cen и S ext , названных в честь их положения относительно вне- или внутриклеточной стороны плазмы. мембрана.Центральное положение образует значительную часть фильтра селективности с консервативными аминокислотами S107, I109, F357 и Y445 в дополнение к менее консервативным F348 и I356 (рисунок; все положения даны для EcClC), которые координируют ион хлорида в пределах проводимости. пути (Dutzler et al., 2002, 2003; Lobet and Dutzler, 2006). Отсутствуют полные положительные заряды, например, от боковых цепей аргинина или лизина, участвующих в формировании сайтов связывания анионов, что согласуется с представлением о том, что белки CLC используют спиральные дипольные моменты для создания положительного электростатического потенциала, необходимого для анионной селективности (Dutzler et al., 2002; Гуо и Маккиннон, 2005).

Отдельные структуры переносчиков CLC демонстрируют сходную складку остова, но, по-видимому, представляют разные конформации цикла обмена Cl /H + . Сравнение этих конформаций показывает движение консервативной боковой цепи глутамата, E148 в EcClC (рис. ), изнутри наружу пути проведения, переключающегося с S cen на S ext . Такие движения зависят от статуса протонирования и, вероятно, объясняют перенос протонов в стехиометрии от 2 Cl до 1 H + (Dutzler et al., 2003; Аккарди и Миллер, 2004 г.; Фэн и др., 2010; Пиколло и др., 2012).

Известно, что два карбоксиконцевых домена CBS эукариотических каналов CLC взаимодействуют и образуют внутримолекулярные димерные комплексы. Частичное удаление доменов CBS может вызвать либо потерю функции, либо изменения в закрытии каналов или внутриклеточном распределении (Maduke et al., 1998; Estévez et al., 2004; Hebeisen et al., 2004; Hebeisen and Fahlke, 2005; Гарсия-Оливарес и др., 2008). Недавняя структура эукариотического транспортера CLC предполагает взаимодействие между доменами CBS и внутриклеточными полюсами спиралей D и R.Поскольку эти спирали содержат боковые цепи серина и тирозина, координирующие S cen (S107 и Y445 в EcClC), это взаимодействие обеспечивает структурную основу для регуляции функции CLC с помощью кларбоксиль-концевых доменов (Hebeisen and Fahlke, 2005; Feng et al. , 2010). Дополнительные межсубъединичные взаимодействия димеров CBS наблюдались in vitro для изолированных карбокси-концов ClC-5 и ClC-Kb (Meyer et al., 2007; Martinez and Maduke, 2008). Такие взаимодействия могут играть роль в межсубъединичной коммуникации и могут способствовать кооперативным гейт-процессам (Быкова и др., 2006).

Функциональные свойства каналов CLC в экспериментах по фиксации напряжения

Гетерологическая экспрессия каналов CLC в ооцитах Xenopus и клетках млекопитающих позволила провести детальный функциональный анализ всех каналов CLC человека. На рисунке показаны записи пэтч-клэмп цельных клеток из клеток HEK293, сверхэкспрессирующих каналы CLC человека, и иллюстрируется функциональное разнообразие этих различных белков. Для всех записей клетки подвергались почти симметричному распределению хлорида поперек плазматической мембраны, держались на уровне 0 мВ, и применялись скачки напряжения в широком диапазоне.

Записи пэтч-клэмп цельных клеток демонстрируют функциональную изменчивость каналов CLC человека. (A-D) Репрезентативные токовые ответы клеток HEK293T, экспрессирующих ClC-1, ClC-2, ClC-Ka/barttin или ClC-Kb/barttin, на указанные протоколы напряжения (левый столбец). В правом столбце показаны зависимости от напряжения вероятностей открытия быстрых протопор (темные кружки) и медленных общих ворот (светлые кружки), а также вероятности того, что канал будет проводящим (жирная линия).Запись ClC-1 воспроизведена из Weinberger et al. (2012), в то время как записи ClC-Ka и -Kb были воспроизведены из Riazuddin et al. (2009).

В то время как амплитуды тока ClC-Ka/barttin и ClC-Kb/barttin почти не зависят от времени, скачки напряжения приводят к зависимой от времени и напряжения релаксации амплитуды тока ClC-1 и ClC-2, которую можно использовать для кинетический анализ ворот канала. Изменения макроскопической амплитуды тока обычно следуют сумме двух экспоненциальных функций с отдельными временными константами.Две константы времени активации и деактивации обусловлены существованием двух воротных механизмов, которые либо действуют на отдельные протопоры, либо совместно на оба протопора (Miller, 1982). Во всех CLC-каналах млекопитающих открытие протопор примерно в 10 раз быстрее, чем обычное открытие (Miller, 1982; Saviane et al., 1999; Fischer et al., 2010; Stölting et al., 2013), что привело к синонимическому использованию термины быстрые/протопоровые ворота и медленные/общие ворота. Для многих каналов эти кинетические различия использовались для разделения двух процессов при записи макроскопических токов.Мгновенная амплитуда тока в хвостовом импульсе фиксированного напряжения переводится в относительную вероятность открытого канала в конце предшествующего испытательного напряжения (Hodgkin and Huxley, 1952). Вставка короткого тестового импульса в напряжение, при котором два процесса стробирования достаточно различаются по скорости, только манипулирует быстрым стробом и, таким образом, эффективно фиксирует его с одинаковой вероятностью открытия для всех предыдущих шагов напряжения. Такой подход позволяет измерять зависимость медленного стробирования от напряжения изолированно.Если предположить, что процессы быстрой и медленной селекции независимы, вероятность открытия быстрых ворот может быть рассчитана как отношение общей вероятности открытия канала к проценту открытых медленных ворот (Accardi and Pusch, 2000).

Хлоридный канал ClC-1 скелетных мышц (рис. ) открыт при 0 мВ, с быстрыми и медленными воротами, которые оба активируются деполяризацией мембраны (Accardi and Pusch, 2000). График зависимости амплитуды тока от мембранного потенциала показывает проводимость внутреннего выпрямления (Fahlke et al., 1995). Повсеместно экспрессируемый ClC-2 закрывается при положительном потенциале и активируется в течение очень медленного времени при гиперполяризации мембраны (рис. 1) (De Santiago et al., 2005). Запуск ClC-2 снова характеризуется двумя кинетически различными процессами ворот, которые оба активируются гиперполяризацией, а не деполяризацией, как в ClC-1. Как ClC-1, так и ClC-2 демонстрируют сильно выпрямляющие макроскопические амплитуды тока внутрь, но с другой механистической основой. Выпрямление каналов ClC-1 внутрь происходит из-за зависящей от напряжения унитарной проводимости, которая уменьшается при положительном напряжении примерно до 10% от проводимости при отрицательном потенциале (Pusch et al., 1994; Фальке и др., 1995; Рычков и др., 1998; Штёльтинг и др., 2014). Напротив, унитарные проводимости тока ClC-2 не зависят от напряжения, а выпрямление токов ClC-2 происходит из-за зависящего от напряжения стробирования, которое закрывает быстрый затвор при положительном напряжении до 0 мВ (Stölting et al., 2013).

ClC-Ka (рис. ) и ClC-Kb (рис. ) могут функционально экспрессироваться только вместе с дополнительной субъединицей барттина (Estévez et al., 2001; Waldegger et al., 2002; Scholl et al., 2006; Fischer et al. др., 2010). В клетках млекопитающих токи ClC-Kb/барттина не зависят от времени с небольшим двунаправленным выпрямлением. Напротив, каналы ClC-Ka/barttin очень быстро закрываются при переходе к отрицательному напряжению до -100 мВ. Эти очень быстрые процессы, вероятно, соответствуют быстрому закрытию протопор в этих каналах (Riazuddin et al., 2009; Fischer et al., 2010). При экспрессии в ооцитах ClC-Ka/barttin и ClC-Kb/barttin обнаруживают резко различающиеся свойства гейтирования (Imbrici et al., 2014). В то время как абсолютные открытые вероятности ClC-Ka/barttin близки к 1 в клетках млекопитающих (Riazuddin et al., 2009), соответствующие значения очень малы в ооцитов Xenopus (Gradogna et al., 2010). Более того, ClC-K каналы, экспрессируемые в клетках млекопитающих, часто реагируют на фармакологическую модификацию иначе, чем каналы, экспрессируемые в ооцитах Xenopus (Imbrici et al., 2014). Причина этих функциональных различий пока не ясна. Могут быть еще неизвестные партнеры взаимодействия ClC-K/barttin, которые присутствуют в одной системе экспрессии, но не присутствуют в другой. Альтернативно, функциональные свойства каналов ClC-K/barttin могут зависеть от состава липидов.Хотя экспрессия в клетках млекопитающих, по-видимому, больше похожа на почечные клетки, чем на ооциты амфибий, в настоящее время невозможно судить, какой из двух различных биофизических и фармакологических фенотипов ближе к функциональным свойствам нативных каналов.

Хлорид, безусловно, является наиболее распространенным анионом in vivo , что также привело к обозначению каналов CLC как «хлоридных» вместо «анионных». Следует отметить, что фильтр селективности каналов CLC не позволяет точно различать различные виды анионов, рассматриваемых как проницаемость для других (нефизиологических) анионов, таких как I , F , SCN , NO . 3 или Br .Однако исследования с использованием другого распространенного физиологического аниона, HCO 3 , проводятся редко. Значительная проницаемость для бикарбоната была обнаружена в исследованиях ClC-5 в ооцитах Xenopus laevis (Mo et al., 1999), а математическое исследование потоков эпителиальных ионов в восходящем колене Генле предсказывает, что значительная бикарбонатная проводимость ClC- Kb необходим для правильной функции почек (Weinstein, 2010).

Двухствольные каналы CLC демонстрируют уникальные свойства одиночного канала

В настоящее время существуют одноканальные записи для большинства каналов CLC человека (рис. ) (Saviane et al., 1999; Фишер и др., 2010; Вайнбергер и др., 2012 г.; Штёльтинг и др., 2013). Таким образом, при анализе записей с мембранных участков, содержащих только один канал CLC, график амплитудной гистограммы показывает в общей сложности три пика, соответствующие закрытому каналу или открытию одной или двух протопор (правая сторона рисунков). Это свойство является результатом уникальной димерной архитектуры каналов CLC с двумя путями ионной проводимости.

Записи отдельных каналов или анализ шума записей целых ячеек предоставляют свойства отдельных каналов CLC.(A–D) 90 010 Репрезентативные одноканальные записи гомодимерного ClC-1, гомодимерного ClC-2, гетероконкатамерного ClC-1-ClC-2, а также ClC-Ka, коэкспрессированного с бартином. Все записи гомодимерных каналов показывают два отдельных открытых состояния, представляющих одну или две одновременно открытые протопоры. ClC-Ka/barttin демонстрирует высокую вероятность открытия, приближающуюся к 1, поэтому наблюдается мало отклонений от полностью открытого состояния. (A–C) были воспроизведены и изменены из Stölting et al. (2014) и (D) от Riazuddin et al.(2009). (E) Репрезентативный график среднего тока и дисперсии клеток HEK293T, экспрессирующих человеческий канал ClC-1 с заменой цистеина 277 на тирозин. Протокол напряжения (вверху), средний ток (в центре) и дисперсия (внизу) получены при pH 5,9, чтобы увеличить вероятность открытия каналов, содержащих этот конкретный мутант. (F) Построение графика отклонения от среднего тока не приводит к простому параболическому распределению. Как и ожидалось, для двухствольных каналов с отдельными протопорами и совместными воротами все точки данных попадают между теоретическим прогнозом для каналов с постоянно открытыми общими воротами (обозначаемыми как «i») или постоянно открытыми воротами протопор (обозначаемыми как «2i»).Переход от одной параболы (штриховая линия) к другой (линия) указывает на медленный переход быстрых ворот из закрытого состояния в открытое во время записи. (G) Линейное преобразование графика в (F) облегчает идентификацию изменений вероятности открытия быстрых ворот. (E-G) были воспроизведены и изменены из Weinberger et al. (2012).

Одноканальные записи прототипа ClC-0 выявили длительные периоды с закрытыми каналами, которые прерывались фазами, в которых обе протопоры быстро переключались между открытым и закрытым состояниями.Во время этих взрывоподобных фаз распределение вероятности встречи с любым из трех уровней амплитуды определяется почти исключительно быстрыми воротами протопор, тогда как длительные закрытые длительности основаны на медленных общих воротах. Поскольку индивидуальная фиксация протопор не зависит от соседней субъединицы, время, проведенное на каждом из трех уровней тока, распределяется биномиально, и такое поведение было названо «биномиальными всплесками» (Miller, 1982). ClC-1 и ClC-2 демонстрируют гейт-процессы, которые напоминают поведение ClC-0, с быстрым гейтированием протопор и медленными кооперативными процессами (рисунки) (Saviane et al., 1999; Аккарди и Пуш, 2000 г.; Суньига и др., 2004). Barttin, по-видимому, блокирует кооперативные ворота в открытой конформации, так что одноканальные записи каналов ClC-Ka/barttin показывают исключительно четное число протопор с независимыми воротами (Fischer et al., 2010). До сих пор не сообщалось об одноканальных записях в гетерологичных системах экспрессии для ClC-Kb.

Анализ гетеродимерных каналов, состоящих из одной субъединицы ClC-1 и одной субъединицы ClC-2, позволил по-новому взглянуть на молекулярную основу медленных кооперативных ворот (Stölting et al., 2014). В таких гетеродимерных каналах отсутствуют кооперативные ворота, но сохраняются два отдельных механизма быстрого и медленного входа для каждой протопоры. В гетеродимерах ClC-1-ClC-2 быстрое открытие протопор ClC-1 напоминает соответствующие процессы в гомодимерах ClC-1. Однако протопора ClC-1 удерживается закрытой при положительном потенциале с помощью новых медленных ворот, которые допускают только временные открытия в гетеродимерной сборке. Напротив, протопора ClC-2 активна при всех потенциалах и находится под контролем быстрых и медленных воротных процессов, которые кинетически отличаются от тех, которые идентифицированы для протопоры ClC-1.В одноканальных записях такое поведение приводило только к одному состоянию проводимости, соответствующему протопоре ClC-2 (рис. ). Эти результаты указывают на то, что общие ворота каналов CLC, в конечном счете, возникают из-за конформационных изменений внутри индивидуального протопора (Bennetts and Parker, 2013; Stölting et al., 2014). Гомодимеризация позволяет синхронизировать эти процессы и общий гейт. В гетеродимерах эта координация нарушена, так что медленные этапы ворот больше не являются кооперативными.

Амплитуды одного канала для протопора ClC-2 были значительно меньше в гетероконкатамерах, чем в гомодимерах ClC-2 (рис. ). В совокупности эти эксперименты демонстрируют, насколько тесно взаимодействуют две субъединицы в рамках одного индивидуального канала. Затвор и проникновение через каждый транспортный белок регулируется электростатическими взаимодействиями между заряженными боковыми цепями или спиральными дипольными моментами. Можно предположить, что изменения в ориентации определенных боковых цепей или спиралей посредством межсубъединичных взаимодействий могут регулировать электростатическое поле соседней субъединицы CLC и, таким образом, кооперативно детерминировать ворота и проникновение.

Анализ шума представляет собой альтернативный метод определения свойств отдельных каналов (Sigworth, 1980). Это особенно полезно для каналов с малой амплитудой унитарного тока и часто помогает коррелировать унитарные и макроскопические токи определенных ионных каналов. Такой анализ основан на предположении, что основные процессы стробирования являются стохастическими событиями и что небольшие отклонения в макроскопической амплитуде тока вызваны флуктуациями числа открытых каналов.В то время как текущий шум, создаваемый каналами только с одним уровнем проводимости, легко анализировать, двуствольная архитектура каналов CLC требует модификации такого анализа шума (Fischer et al., 2010; Weinberger et al., 2012).

Скачки напряжения вызывают релаксацию вероятности открытия зависимых от напряжения каналов от предыдущего равновесного значения к новому и приводят к зависящим от времени изменениям амплитуды тока. Во время этих токовых релаксаций амплитуда тока одного канала постоянна, тогда как количество открытых каналов изменяется.Повторная выборка откликов тока на один и тот же скачок напряжения (рисунок ) позволяет определить средний ток по всем зарегистрированным скачкам напряжения и средние отклонения для нескольких моментов времени после скачка напряжения. Для каналов только с одним состоянием проводимости график дисперсии тока (σ 2 ) по сравнению со средней амплитудой < I > (рис. ) дает параболическое распределение, которое зависит от: амплитуды одного канала ( i ) и количество каналов ( N ).

σ2=  i〈I〉−(〈I〉2N)

или после линеаризации делением дисперсии на ток

Некоторые CLC-каналы показывают значительное отклонение от этой теории, которое становится еще более очевидным после линеаризации параболического графика ( цифры). В основе этого своеобразного соотношения ток-дисперсия лежит двуствольная архитектура этих каналов. Взятие двух протопор с двумя структурно и кинетически различными процессами ворот позволяет удовлетворительно количественно оценить это поведение.Макроскопический ток каналов ХЖК определяется как произведение вероятности открытия каждых ворот, количества каналов и удвоенной амплитуды одиночной протопоры: P ( T ( T ) · P C ( T ( T )

Текущий дисперсию зависит от количества каналов ( N ), единственная амплитуда протопора ( I ) и зависящие от времени вероятности открытия для быстрых протопоровых ворот ( P p ( t )) и медленных общих ворот ( P c ( t )):

6 ) = N · 2 I · 2 I 2 · P P P ( T ) · P C ( T ) · (1 — 2 P р ( т ) ·  9 0005 P c ( t ) + P p ( t ))

Эти уравнения можно упростить до:

σ2=  (1+Pp(t))·i〈I〉−(〈I〉2N)

демонстрируя, что эта количественная обработка позволяет определить амплитуду одного канала, если известна одна из двух открытых вероятностей.Даже если график дисперсии тока не показывает очевидных отклонений от параболической формы, необходимо учитывать зависимость начального наклона от минимальной вероятности открытия протопоровых ворот ( P p ).

Во всех случаях текущая дисперсия должна находиться между двумя крайними значениями:

I〉22N)             для Pc(t)=1

Используя такой анализ, мы продемонстрировали, что мутация C277Y, вызывающая миотонию, приводит к значительному снижению вероятности медленного открытия ворот (Weinberger et al., 2012). Предполагая, что максимальное значение, равное удвоенному наименьшему определенному соотношению дисперсии/текущего тока, эти результаты также продемонстрировали уменьшенные амплитуды одного канала по сравнению с ClC-1 дикого типа из одноканальных записей. Это открытие является довольно неожиданным, поскольку С277 не участвует в формировании проводящего пути в известных трехмерных структурах. Это обеспечивает дополнительную поддержку понятия тесного взаимодействия субъединиц в определении свойств ворот и проникновения CLC-каналов.

Молекулярные детерминанты функции канала CLC

За последние 20 лет сочетание сайт-направленного мутагенеза и функционального анализа мутантных каналов позволило понять механизмы и детерминанты последовательности ворот канала CLC и проникновения анионов. Эксперименты по сайт-направленному мутагенезу на нескольких каналах CLC продемонстрировали, что один и тот же консервативный глутамат в начале спирали F, движение которого необходимо для транспорта протонов в антипортерах CLC, важен для быстрого запуска в ClC-0, ClC-1 и ClC-2. (Фальке и др., 1997; Дутцлер и др., 2003 г.; Нимейер и др., 2003; De Santiago et al., 2005) и поэтому был назван «запирающим глутаматом». В каналах ClC-K этот «запирающий глутамат» заменяется валином, поэтому часто предполагается, что ClC-Ka и ClC-Kb не имеют протопорных затворов. Тем не менее, одноканальные записи от ClC-Ka/barttin выявили короткие события стробирования и очень высокую вероятность открытия канала (Riazuddin et al., 2009; Fischer et al., 2010). Было обнаружено, что время, проведенное в открытом и закрытом состояниях, распределяется биномиально, а самый высокий наблюдаемый уровень проводимости всегда был кратным двум, демонстрируя, что наблюдаемые переходы открытия и закрытия вызваны отдельными воротами протопор без вмешательства постоянно открытых общих ворот (Riazuddin). и другие., 2009; Фишер и др., 2010). Гомологичный крысиный ClC-K1 также функционален в отсутствие бартина и, таким образом, дает возможность более подробно изучить влияние бартина на функцию ClC-K. В отсутствие бартина в rClC-K1 проявляются протопоры и общие вентильные процессы с противоположной зависимостью от напряжения. Совместная экспрессия с бартином приводит к постоянному открытию общих ворот, опять же, как показано биномиальным распределением гистограмм амплитуды для каждого состояния проводимости при совместной экспрессии с бартином (Fischer et al., 2010). Хотя результаты подразумевают, что боковые цепи, отдельные от исходного «запирающего глутамата», должны быть вовлечены в затвор протопор, точная молекулярная основа такого затвора еще не идентифицирована в каналах ClC-K.

В ClC-0, ClC-1 и ClC-2 цистеин находится рядом с интерфейсным доменом и в непосредственной близости от S ext (C212 в ClC-0, C277 в ClC-1 или C258 в ClC-2) играет решающую роль в медленном кооперативном гейтировании (Lin et al., 1999; Accardi et al., 2001; Zúñiga et al., 2004; Де Сантьяго и др., 2005 г.; Вайнбергер и др., 2012). Опять же, в каналах ClC-K отсутствует цистеин в этом положении, что позволяет предположить, что эта боковая цепь не требуется для общего управления воротами. Основываясь на трехмерных структурах CLC-антипортеров, недавно было высказано предположение, что медленное совместное запирание ClC-0 и ClC-1 зависит от остатка тирозина, который координирует центральный сайт связывания хлорида (Bennetts and Parker, 2013). Считается, что этот тирозин взаимодействует с глутаматом селектора в качестве последнего шага медленного селектора, чтобы закупорить или открыть пору.Однако до сих пор неизвестно, каким образом общие ворота одновременно передаются обеим протопорам. Неизвестно даже, находятся ли антипортеры в семействе CLC под контролем кооперативного воротного механизма. Однако на основании предыдущих исследований кажется разумным, что перегруппировка карбокси-конца может потребоваться для кооперативного гейтирования (Bykova et al., 2006; Garcia-Olivares et al., 2008; Ma et al., 2011; Stölting et al. ., 2013).

Преобразование антипортеров CLC в каналы/унипортеры

Для понимания структурных особенностей, отличающих анионный канал CLC от анион-протонного обменника, были предприняты попытки преобразовать антипортеры CLC в анионные каналы или наоборот.Однако пока эти попытки не увенчались полным успехом. Замена остатка глутамата («затворный глутамат» E148 в EcClC) в спирали F на аланин отменяет вторично-активный транспорт и делает возможным пассивное проникновение анионов (Accardi and Miller, 2004; Jayaram et al., 2008). Соответствующий обмен также устранил связь транспорта протонов с потоком хлорида в человеческих анион/протонных антипортерах ClC-4 и ClC-5 (Picollo and Pusch, 2005; Scheel et al., 2005). Другой остаток глутамата в EcClC (E203) также может быть нейтрализован заменой на аланин, чтобы нарушить связь транспорта хлоридов и протонов, что приведет к переключению на каналоподобный фенотип, возможно, из-за отсутствия внутреннего сайта связывания протонов (Accardi и другие., 2005). Некоторые замены центрального тирозина (Y445 в EcClC) также приводили к кажущемуся канальному фенотипу с сильным уменьшением наблюдаемой плотности анионов для S cen в сопутствующих рентгеновских кристаллических структурах (Accardi et al., 2006). Мутация E148 вместе с Y445 увеличивала транспорт унитарных анионов в EcClC выше значений, наблюдаемых для унипортеров, однако наблюдаемые скорости проводимости были значительно ниже соответствующих значений в каналах CLC (Jayaram et al., 2008). Следует отметить, однако, что все эти остатки в основном сохраняются даже в канальной ветви семейства CLC, что дает важную информацию о процессе проводимости анионов и протонов, но не позволяет продемонстрировать фактическую разницу между транспортерами и каналами из одного и того же семья.Сообщений о преобразовании канала CLC в антипорт пока нет.

Клеточная физиология и патофизиология каналов CLC

CLC-1

Скелетные мышцы взрослых уникальны среди возбудимых тканей благодаря высокой проводимости хлоридов в покое. Он превышает сарколеммальную калиевую проводимость более чем в четыре раза и настолько высок, что изменения внеклеточных концентраций хлоридов не изменяют потенциал покоя, а скорее приводят к изменениям внутриклеточного [Cl ] до тех пор, пока равновесный потенциал ионов хлора снова равняется потенциалу покоя мышц (Hodgkin and Horowicz, 1959; Bretag, 1987).Физиологическая роль ClC-1 стала ясна при изучении патофизиологии врожденной миотонии, редкого состояния человека, характеризующегося ригидностью мышц при резких резких движениях (Bryant and Morales-Aguilera, 1971; Adrian and Bryant, 1974). В миотонических мышечных волокнах мембранный потенциал не полностью реполяризуется после серии потенциалов действия во время произвольных сокращений, что приводит к так называемой постдеполяризации. Постдеполяризации могут приводить к длительной электрической активности мышечных волокон даже после прекращения активности нейронов и, таким образом, являются электрофизиологической основой ригидности мышц (Adrian and Bryant, 1974).Временной ход самого потенциала действия не изменяется в мышечных волокнах миотонической козы, что указывает на то, что ClC-1 не способствует реполяризации самого потенциала действия (Bryant, 1973).

Последеполяризация миотонических мышечных волокон происходит из-за накопления K + в Т-трубочках, что происходит как в нормальных, так и в миотонических мышцах во время повторяющихся потенциалов действия. В нормальных скелетных мышцах высокая проводимость хлоридов в состоянии покоя снижает константу длины сарколеммы и предотвращает распространение этой деполяризации вдоль сарколеммы.В отсутствие шунтирующей сарколеммальной хлоридной проводимости в миотонической мышце деполяризация t-трубочек приводит к деполяризации мембраны сарколеммы, вызывая устойчивую активность мышечного волокна. До сих пор ведутся споры о том, обеспечивает ли ClC-1 свою шунтирующую проводимость только через каналы, локализованные вдоль наружной сарколеммальной мембраны или также вдоль t-трубочек. Недавнее исследование представило доказательства однородного распределения в Т-трубочках и мембране сарколеммы (DiFranco et al., 2011), в то время как в другой статье описывается эксклюзивная экспрессия в поверхностной мембране (Lueck et al., 2010). Независимо от точной локализации, хлоридные каналы в мышцах позволяют волокнам скелетных мышц электрически переносить инвагинации t-тубулярной мембраны и последующее накопление калия (Рисунки).

ClC-1 является основным хлоридным каналом в мышцах. (A) В скелетных мышцах мембранный потенциал покоя определяется градиентом калия через сарколеммальную и Т-трубчатую мембраны.Потенциалы действия приводят к открытию кальциевых каналов L-типа (DHPR), которые, в свою очередь, открывают внутриклеточные каналы (RyR), высвобождающие кальций из саркоплазматического ретикулума, необходимый для сокращения мышцы. (B) Последовательность потенциалов действия приводит к перемещению калия через каналы во внеклеточную сторону. Поскольку диффузия ионов из Т-трубочек идет медленно, калий накапливается и вызывает временные изменения калиевого реверсивного потенциала, которые, однако, компенсируются высокой проводимостью сарколеммального хлорида. (C) В мышечных волокнах, экспрессирующих дисфункциональные каналы ClC-1, деполяризация t-трубочек распространяется на поверхностную мембрану и может запускать спонтанную генерацию новых потенциалов действия даже после окончания произвольного движения. Эта «последеполяризация» отмечена красным. (D) Репрезентативные записи мутантных каналов ClC-1, несущих болезнетворные мутации, иллюстрирующие разнообразные результаты замены отдельных аминокислот при гейтировании ClC-1.

ClC-1 был клонирован из скелетных мышц как первый член семейства CLC млекопитающих (Steinmeyer et al., 1991). Мутации в CLCN1 как генетическая основа врожденной миотонии доказали, что ClC-1 действительно представляет собой хлоридный канал взрослых скелетных мышц (Koch et al., 1992; George et al., 1993). ClC-1 демонстрирует внутреннюю проводимость унитарного тока при симметричных концентрациях хлоридов со значением примерно на 1,5 пСм ниже -85 мВ и в 10 раз более низкую проводимость при напряжениях, положительных по отношению к потенциалу обращения хлоридов (Pusch et al., 1994; Stölting et al. др., 2014). ClC-1 имеет открытую вероятность 0.38 при -85 мВ (Weinberger et al., 2012) и минимально открывается только во время подъема потенциала действия, что быстрее, чем время активации ClC-1 (Fahlke and Rüdel, 1995; Accardi and Pusch, 2000; Hebeisen). и Фальке, 2005). Эти специфические свойства анионной проводимости и гейтирования делают ClC-1 идеально подходящим для обеспечения большой проводимости хлорида в состоянии покоя с минимальным вмешательством в потенциал действия. Эти свойства сводят к минимуму приток Na + во время потенциала действия и, таким образом, снижают потребление АТФ после продолжительной мышечной активности, которая необходима для активной экструзии Na + с помощью Na + /K + -АТФазы.

Хотя потенциал-зависимое гейтирование ClC-1 не является строго необходимым для его физиологической функции, почти все болезнетворные мутации, которые были изучены, нарушают гейтирование канала [за заметным исключением G230E, который влияет на проникновение ионов и селективность ClC-1 (Фальке и др., 1997)]. Первая мутация миотонии, которая была функционально проанализирована, D136G (рис. 1), связывает открытие канала с внутриклеточной концентрацией хлорида и, таким образом, инвертирует зависимость ClC-1 от напряжения (Fahlke et al., 1995). D136G hClC-1 открывается только при напряжении ниже равновесного потенциала хлорида. Отток хлоридов при таких напряжениях будет снижать внутриклеточную концентрацию хлоридов до достижения потенциала реверсии хлоридов, подобного потенциалу покоя сарколеммы. При этом [Cl ] D136G hClC-1 будет постоянно закрыт, что полностью согласуется с низкой проводимостью хлоридов в покое и повышенной возбудимостью. D136G hClC-1 напоминает ClC-2 по многим свойствам и, таким образом, иллюстрирует важность специфичной для изоформ специализации внутри семейства CLC.Впоследствии было идентифицировано несколько мутаций, которые сместили кривую активации ClC-1 в сторону более деполяризованных потенциалов (Pusch et al., 1995; Rhodes et al., 1999; Wu et al., 2002) (рис. 1). Такие сдвиги уменьшают открытую вероятность hClC-1 при -85 мВ и, таким образом, снижают проводимость хлорида в покое. Сходное изменение ворот канала лежит в основе миотонии у коз (Beck et al., 1996). Другие мутации приводят к изменениям ворот, так что два процесса ворот развивают противоположный паттерн зависимости от напряжения, один стимулируется деполяризацией мембраны, а другой гиперполяризацией, как в каналах T550M ClC-1 (Warnstedt et al., 2002; Ву и др., 2002; Вайнбергер и др., 2012). За последние два десятилетия у пациентов с врожденной миотонией было обнаружено большое разнообразие болезнетворных мутаций. Эти мутации распространены по всей кодирующей области ClC-1, и их функциональный анализ дал много важных сведений о последовательностях, определяющих функцию канала CLC (Fahlke et al., 1995, 1997; Wollnik et al., 1997; Saviane et al. ., 1999; Richman et al., 2012; Weinberger et al., 2012; Lee et al., 2013).

Недавно новый вариант ClC-1 был идентифицирован экзономическим секвенированием у пациентов, страдающих идиопатической эпилепсией (Chen et al., 2013). Это исследование также показало транскрипты мРНК ClC-1 и белковые полосы, окрашенные антителами против ClC-1 в частях головного мозга человека. Эта новая роль и локализация ClC-1 может привести к новым перспективам физиологии каналов CLC в центральной нервной системе. Однако отсутствие центральных неврологических симптомов у пациентов с врожденной миотонией или у животных, моделирующих это заболевание, поднимает вопрос о том, как функциональные изменения ClC-1 могут способствовать развитию эпилепсии.

CLC-2

ClC-2 был обнаружен вскоре после ClC-1 как в возбудимых, так и в невозбудимых клетках (Thiemann et al., 1992). ClC-2 демонстрирует независимую от напряжения проводимость одного канала всего ~ 2,4 пСм на протопору (Stölting et al., 2013). Он закрывается при положительных потенциалах и активируется в течение очень медленного времени при гиперполяризации. После активации при отрицательных потенциалах напряжение возвращается к положительным потенциалам, что приводит к очень медленной деактивации тока. В то время как протопорные ворота полностью закрываются при положительных потенциалах, медленные общие ворота демонстрируют минимальную вероятность открытия значительно выше нуля (De Santiago et al., 2005; Гарсия-Оливарес и др., 2008). Сходные особенности гейтирования наблюдались в ооцитах Xenopus и в клетках млекопитающих, однако кинетика активации и деактивации была значительно медленнее в ооцитах. Кинетика гейтирования модифицируется связыванием нуклеотидов с карбокси-концом (Dhani et al., 2008; Stölting et al., 2013) и составом окружающих липидов (Hinzpeter et al., 2007). Также было обнаружено, что активация и деактивация ClC-2 значительно ускоряются делециями или модификациями карбокси- или амино-концевых доменов, что предполагает участие больших перестроек этих белковых доменов (Garcia-Olivares et al., 2008; Сен-Мартен и др., 2009 г.; Stölting et al., 2013), например, для ClC-0 и ClC-1 (Быкова и др., 2006; Ma et al., 2011).

Запирание ClC-2 зависит от внутриклеточного [Cl ], так что открытие канала происходит только при потенциалах, отрицательных по отношению к равновесному потенциалу Cl (Niemeyer et al., 2004). В клетках, в которых мембранный потенциал ограничен каналами различной селективности в сторону более отрицательных потенциалов, можно предположить, что ClC-2 будет оставаться открытым и обеспечивать отток анионов до тех пор, пока равновесный потенциал хлоридов не сравняется с мембранным потенциалом.Таким образом, ClC-2 может способствовать регуляции внутриклеточных концентраций анионов в нейронах, глии или оттоку хлоридов в эпителиальных клетках. Ранние исследования ClC-2, гетерологически экспрессируемого в ооцитах Xenopus , выявили активацию с помощью осмотических градиентов, подтверждая, что ClC-2 может быть вовлечен в клеточный осмотический гомеостаз (Gründer et al., 1992). Однако функциональные свойства ClC-2 явно отличаются от активируемых объемом анионных каналов (Nilius et al., 1997), а клетки, лишенные ClC-2, демонстрируют неизмененные активируемые объемом анионные потоки (Nehrke et al., 2002).

ClC-2 может собираться с дополнительными субъединицами, которые не требуются для функции ClC-2, а скорее определяют субклеточную локализацию и модифицируют селекцию канала в различных типах клеток. Первой описанной вспомогательной субъединицей ClC-2 был белок cereblon, который связывается с карбокси-концом ClC-2 и предположительно регулирует экспрессию функциональных каналов в сетчатке (Hohberger and Enz, 2009). Совсем недавно было показано, что новая субъединица под названием GlialCAM (синоним более раннего обозначения HepaCAM) связана с ClC-2 (Jeworutzki et al., 2012). GlialCAM представляет собой белок длиной 416 аминокислот с одним трансмембранным доменом и большим Ig-подобным аминоконцевым доменом V- и C2-типа. В гетерологичных системах экспрессии совместная экспрессия GlialCAM с ClC-2 переключала фенотип в сторону почти конститутивно открытого канала. Хотя GlialCAM взаимодействует только с ClC-2 in vivo из-за его специфичной для клеток экспрессии, было обнаружено, что он связывается с несколькими каналами CLC in vitro , такими как ClC-0, ClC-1 и ClC-K/barttin влияющие на локализацию и общие параметры ворот (Jeworutzki et al., 2014).

Токи ClC-2, записанные на срезах головного мозга животных, нокаутированных по GlialCAM, не сильно отличаются от соответствующих следов, полученных у животных дикого типа, что позволяет предположить, что GlialCAM не оказывает такого резкого эффекта на вход канала в нативных клетках, как в гетерологичной системе экспрессии ( Hoegg-Beiler и др., 2014). Работа над мышами с нокаутом MLC1 также показала, что MLC1, мембранный белок с неизвестной функцией, ассоциированный с мегалэнцефальной лейкоэнцефалопатией (Leegwater et al., 2001), может стабилизировать GlialCAM в плазматической мембране и, таким образом, действовать как дополнительный партнер по связыванию в комплексе ClC-2/GlialCAM (Hoegg-Beiler et al., 2014).

Среди наиболее понятных функций ClC-2 является отток хлоридов через базолатеральную мембрану в желудочно-кишечный тракт, облегчающий реабсорбцию NaCl и впоследствии H 2 O (рис. ) (Catalán et al., 2002, 2004). Предполагаемый активатор ClC-2, лубипростон, улучшает течение хронического идиопатического запора, вероятно, за счет стимуляции секреции хлоридов и воды в просвет толстой кишки.Успех этого лечения согласуется с ролью ClC-2 также в апикальной секреции хлоридов (Cuppoletti et al., 2004). Во время разработки ClC-2 сильно экспрессируется в легочной ткани и был предложен в качестве потенциального пути для замены отсутствующей проводимости хлоридов у пациентов, страдающих муковисцидозом (Schwiebert et al., 1998, -2). Однако мыши Clcn 2 -/- не страдают легочными заболеваниями, а дополнительный нокаут ClC-2 у мышей CFTR -/- не ухудшил фенотип муковисцидоза у этих животных (Zdebik et al. др., 2004). Исследования мышей с нокаутом также выявили дегенерацию яичек и дегенерацию сетчатки, что подчеркивает роль ClC-2 в пигментном эпителии сетчатки и в клетках Сертоли, где этот канал может участвовать в регуляции высокоспециализированной секреции жидкости этими тканями (Bösl et al. ., 2001). Хотя это и не связано с каким-либо почечным заболеванием, экспрессия ClC-2 также была обнаружена в почках (Thiemann et al., 1992). Анализ транскриптов мРНК выявил значительную экспрессию во всех сегментах нефрона, за исключением кортикального собирательного протока и наружного мозгового вещества собирательного протока, и было обнаружено, что он модулируется альдостероном у крыс (Ornellas et al., 2002). Было также показано, что ClC-2 экспрессируется в скелетных мышцах (Thiemann et al., 1992). Однако токи ClC-2 не могли быть зарегистрированы ни в почках, ни в скелетных мышцах. Вполне возможно, что ClC-2 может образовывать гетеродимеры в этих тканях, где экспрессируются другие каналы CLC, такие как ClC-1 (Lorenz et al., 1996; Stölting et al., 2014) или каналы ClC-K.

ClC-2 экспрессируется в эпителии, а также в возбудимых клетках. (A) В энтероцитах толстой кишки хлорид абсорбируется со стороны просвета через хлоридно-бикарбонатный обменник, а затем транспортируется через базолатеральный ClC-2 в интерстиций.Натрий следует через просветный канал или натрий/протонный обменник и транспортируется в интерстиций с помощью Na + /K + АТФазы (Catalán et al., 2002). (B) Роль ClC-2 в возбудимых клетках, таких как нейроны, все еще обсуждается. Вероятный механизм оставляет ClC-2 закрытым при эквивалентном калиевом мембранном потенциале покоя, но изменения потенциала реверсии хлоридов за счет притока Cl открывают ClC-2 и обеспечивают отток хлоридов через этот канал.Отток хлоридов, возможно, вызывает деполяризацию мембран и повышенную возбудимость. (C) Одноканальные записи мутантных каналов ClC-2 с мутациями, обнаруженными у пациентов с идиопатической эпилепсией. Эти мутации сокращают длительные закрытые состояния, вызванные закрытием общих ворот. (D) График вероятности нахождения канала ClC-2 в закрытом состоянии в течение указанного времени демонстрирует ассоциированные с заболеванием изменения общего. (E) W570X, недавно обнаруженный у пациентов с идиопатической генерализованной эпилепсией, вызывает такое же ускорение активации и деактивации ClC-2, как и ранее изученный мутант H573X, при экспрессии в клетках HEK293. (F) H573X частично открывает медленные ворота ClC-2. (C,D) были воспроизведены и изменены из Stölting et al. (2013). Данные H573X ClC-2 были воспроизведены и изменены из Garcia-Olivares et al. (2008).

ClC-2 экспрессируется в нейрональных и глиальных клетках (Staley, 1994; Nobile et al., 2000; Sìk et al., 2000), но его роль в центральной нервной системе еще недостаточно изучена. Мутации в гене CLCN2 были обнаружены у пациентов с идиопатической генерализованной эпилепсией, а также при лейкоэнцефалопатии (D’Agostino et al., 2004; Клефус-Ли и др., 2009 г.; Сен-Мартен и др., 2009 г.; Классен и др., 2011; Депьен и др., 2013; Штёльтинг и др., 2013). Мутации потери функции CLCN2 приводят к вакуолизации миелина в головном и спинном мозге и к легким неврологическим нарушениям, таким как мозжечковая атаксия (Depienne et al., 2013). Отсутствие ClC-2 вызывает аналогичные патологические изменения у пациентов-людей, наблюдаемые у мышей Clcn 2 -/- . Сходные изменения в морфологии мозга вызываются потерей GlialCam и MLC1, скорее всего, потому, что эти белки собираются в белковый комплекс, препятствующий образованию таких вакуолей.

Clcn 2 -/- мыши демонстрируют аномальную корковую активность и более высокую восприимчивость к индуцированным припадкам, но не проявляют явных признаков эпилептических припадков у животных (Blanz et al., 2007; Cortez et al., 2010). Изменения в динамической регуляции внутринейрональной концентрации хлоридов могут лежать в основе этой повышенной возбудимости (Blanz et al., 2007; Földy et al., 2010). Активация рецепторов GABA A гиперполяризует нейроны за счет временного притока хлоридов.ClC-2 может активироваться в результате увеличения внутриклеточного [Cl ] и обеспечивать путь выхода ионов хлорида (рис. 1). Этот механизм был впервые продемонстрирован в экспериментах, в которых ClC-2 экспрессировался в ганглиозных клетках задних корешков. Этот маневр уменьшил [Cl ] int и инвертировал деполяризующие токи в гиперполяризующие ГАМК (Staley et al., 1996). Другой возможный механизм постулирует, что каналы ClC-2 могут оставаться открытыми при положительном напряжении и обеспечивать реполяризующий приток хлорида (Ratté and Prescott, 2011).

Несколько миссенс-мутаций CLCN2 , обнаруженных у пациентов, страдающих идиопатической эпилепсией, изменяют гейтирование ClC-2 сходным образом (рисунки ), т. е. более быстрое время активации и деактивации. Это однородное функциональное последствие поддерживает представление о том, что эти изменения в закрытии каналов могут способствовать патогенезу эпилепсии. У мутанта ClC-2 отток хлорида после повторной стимуляции ГАМК будет активироваться быстрее и, таким образом, проводить деполяризующий ток с более быстрым началом, чем каналы дикого типа.Причинная роль мутаций CLCN2 в прошлом подвергалась сомнению несколькими авторами (Niemeyer et al., 2010; Depienne et al., 2013; Jentsch, 2013). Одним из аргументов было то, что эти мутации не связаны с эпилепсией в менделевском стиле. Некоторые из этих вариаций последовательности обнаруживают неполную косегрегацию и встречаются не только у пораженных, но и у здоровых особей одной и той же семьи. Однако такой тип наследования не является редкостью при идиопатической генерализованной эпилепсии. Появляется все больше доказательств того, что это заболевание возникает не просто из-за возникновения отдельных болезнетворных мутаций, а скорее является результатом сосуществования множественных вариаций последовательностей, влияющих на разные гены (Klassen et al., 2011). Проявление и тяжесть заболевания зависят от комбинированных функциональных последствий множественных совпадающих генетических факторов риска, способствующих повышенной возбудимости центральной нервной системы. Модель полигенной гетерогенности предполагает, что мутации CLCN2 и влияют на возбудимость нейронов, но эти изменения приводят только к эпилепсии вместе с мутациями в других генах (Klassen et al., 2011).

Одна из мутаций, связанных с идиопатической эпилепсией, W570X, также была идентифицирована в исследовании секвенирования генома пациентов с лейкоэнцефалопатией (Depienne et al., 2013). Эта мутация очень похожа на укорочение ClC-2, изученное ранее в нашей лаборатории, и вызывает сильное ускорение активации и инактивации ворот с почти постоянно открытыми медленными воротами (Рисунки) (Garcia-Olivares et al., 2008). Однако у пациента, страдающего лейкоэнцефалопатией, не было судорог, предположительно из-за почти полной деградации усеченного мутантного канала (Depienne et al., 2013).

CLC-Ka/CLC-Kb

ClC-Ka и ClC-Kb экспрессируются исключительно в нефроне и сосудистой полоске внутреннего уха (рис. ).Физиологическая роль этих белков была выяснена после появления мыши Clcnk 1 -/- (ClC-K1 является гомологом ClC-Ka для грызунов) с выраженным несахарным диабетом и сцеплением CLCNKB с Синдром Барттера, состояние человека, характеризующееся нарушением концентрации почечной мочи, что приводит к гипотензии с повышенными уровнями ренина и альдостерона (Simon et al., 1997; Matsuura et al., 1999). Эти данные свидетельствуют о том, что ClC-Ka и ClC-Kb имеют решающее значение для нормальной концентрации мочи.

ClC-K каналы необходимы для трансэпителиального транспорта растворенных веществ в петле Генле и сосудистой полоске внутреннего уха. (A) Экспрессия ClC-Ka/barttin и ClC-Kb/barttin в тонкой восходящей и толстой восходящей части петли Генле. Хлорид абсорбируется на просветной стороне либо за счет вторично-активного транспортного механизма, либо путем диффузии через апикальные каналы, а затем проводится через ClC-Ka/барттин или ClC-Kb/барттин к интерстициальной стороне. ClC-Ka/barttin необходим для пассивной реабсорбции NaCl в тонких восходящих ветвях.В толстой восходящей части ClC-Kb/barttin поддерживает базолатеральный отток хлоридов, необходимый для электрогенной абсорбции NaCl. Поглощение NaCl устанавливает трансэпителиальный потенциал, который дополнительно управляет парацеллюлярным потоком Mg 2+ или Ca 2+ . (B) ClC-Ka/barttin и ClC-Kb/barttin опосредуют базолатеральный отток хлоридов и поддерживают зарядку эндолимфы посредством секреции K + в сосудистой полоске. (C) Считается, что Барттин связывается со спиралью B (пурпурный) и J (синий) каналов ClC-K (Tajima et al., 2007). (D) Конфокальные флуоресцентные изображения (любезно предоставленные доктором Даниэлем Войцеховски) только YFP-ClC-Ka показывают преимущественное окрашивание внутриклеточных мембран (слева). При совместной экспрессии CFP-barttin ClC-Ka перемещается на плазматическую мембрану (правая сторона). (E) Барттин переключает ClC-Ka и ClC-Kb в активное состояние, как видно на нормализованном графике зависимости тока от напряжения. (F) Барттин увеличивает комплексное гликозилирование (#) и стабильность комплекса ClC-K/барттин в плазматической мембране. (A,B) изменены после Fahlke and Fischer (2010).

Первоначальные попытки охарактеризовать функцию этих каналов не увенчались успехом (Kieferle et al., 1994), поскольку ClC-Ka и Kb могут функционально экспрессироваться только вместе с дополнительной субъединицей бартина (Estévez et al., 2001; Waldegger et al., 2002; Шолль и др., 2006). Барттин был клонирован как продукт гена болезни синдрома Барттера 4 типа, сочетающего выраженные почечные симптомы других синдромов Барттера с нейросенсорной глухотой (Birkenhäger et al., 2001). Это белок из 320 аминокислот, который содержит два предполагаемых трансмембранных домена, за которыми следует длинный карбокси-конец. Укорочения barttin после положения 72 практически не затрагивают функцию ClC-K/barttin каналов в гетерологичных системах экспрессии (Scholl et al., 2006; Janssen et al., 2009). Предполагается, что взаимодействие Барттина с каналами ClC-K происходит вдоль двух трансмембранных спиралей B и J, но дополнительные подробности о взаимодействии канала и вспомогательной субъединицы все еще отсутствуют (рис. ) (Tajima et al., 2007).

У мышей и крыс ClC-K1, ClC-K2 и барттин распределяются, начиная с тонкого и заканчивая толстым восходящим протоком петли Генле и заканчивая собирательным протоком (Vandewalle et al., 1997; Waldegger et al. , 2002; Ниссан и др., 2004). Две изоформы ClC-K, однако, демонстрируют различия в их экспрессии в разных частях нефрона, так что в настоящее время считается, что каналы, состоящие из ClC-Ka и бартина, опосредуют прохождение Cl через эпителий преимущественно в тонком восходящем эпителии. конечности, в то время как ClC-Kb/barttin, как полагают, необходим для обратного захвата хлоридов в толстой восходящей конечности и поддержания трансэпителиального потенциала, который приводит к парацеллюлярной абсорбции различных катионов, включая Ca 2+ и Mg 2+ .ClC-K и barttin также проявляют обильную экспрессию в сосудистой полоске внутреннего уха. Каналы ClC-K/barttin обеспечивают базолатеральный отток ионов Cl , накопленных котранспортером NKCC1 Na + -K + -Cl , что необходимо для генерации эндокохлеарного потенциала.

Ни экспрессия ClC-Ka, ни ClC-Kb не приводят к видимым токам при отсутствии субъединицы бартина. Барттин выполняет несколько функций на каналах ClC-K.Он поддерживает выход из эндоплазматического ретикулума, стимулирует вставку и нарушает удаление ClC-Ks из поверхностной мембраны (рис. 1) (Scholl et al., 2006). Более того, барттин повышает стабильность белка ClC-K за счет стимуляции комплексного гликозилирования (Рисунки) (Hayama et al., 2003; Scholl et al., 2006; Janssen et al., 2009). ClC-Ka и ClC-Kb не функционируют без вспомогательной субъединицы и переключаются в проводящее состояние за счет ассоциации с бартином. При совместной экспрессии ClC-Ka и ClC-Kb проявляют независимые от времени, в основном не выпрямляющие токи (Janssen et al., 2009; Фишер и др., 2010). Каналы ClC-Ka/барттина постоянно открыты при положительном напряжении до -150 мВ. Спад вероятности размыкания при отрицательном напряжении до -150 мВ приводит к характерному «крючку» на макроскопических графиках вольт-амперной характеристики. Одноканальная проводимость ClC-Ka составляет примерно 30 пСм и, таким образом, значительно больше, чем у других каналов CLC (рис. 1). До сих пор не определены унитарные свойства ClC-Kb.

Несколько миссенс-мутаций CLCNKB были обнаружены у пациентов с синдромом Барттера (Simon et al., 1997; Фукуяма и др., 2004). Эти мутации обычно вызывают потерю функции канала и, таким образом, ожидается, что они уменьшат реабсорбцию воды, влияя на кортико-медуллярный осмотический градиент. Имеется одно сообщение о пациенте с комбинированными мутациями в CLCNKA и CLCNKB . Как и ожидалось, пациент страдает тяжелой формой почечной недостаточности и нейросенсорной глухотой, которые очень похожи на мутации в гене BSND , которые также влияют на оба хлоридных канала одновременно (Schlingmann et al., 2004). Одна мутация, предсказывающая T481S ClC-Kb, была обнаружена при генетическом скрининге когорт гипертоников. В гетерологичных системах экспрессии это позволяет открывать каналы ClC-Kb даже в отсутствие бартина (Jeck et al., 2004; Sile et al., 2009). Мутация может увеличить реабсорбцию соли и, следовательно, воды и, таким образом, повысить системное кровяное давление. Более того, увеличение токов хлора в сосудистых полосках увеличивает эндокохлеарный потенциал и тем самым снижает порог слышимости (Frey et al., 2006). Поскольку уменьшение объема крови за счет увеличения экскреции воды может усилить секрецию ренина и активировать ренин-ангиотензин-альдостероновую систему (РААС), потеря функции ClC-K/бартиновых каналов может увеличить риск сердечной недостаточности. Недавно сообщалось, что вариант CLCNKA , предсказывающий R83G ClC-Ka, приводит к потере функции этого канала и был предложен как фактор риска сердечной недостаточности (Cappola et al., 2011). Другие встречающиеся в природе варианты ClC-Ka, которые повышают системное кровяное давление после увеличения нагрузки NaCl, были связаны с хронической солевой гипертензией (Barlassina et al., 2007).

Важная роль ClC-K/бартиновых каналов в регуляции содержания соли и воды в организме делает эти каналы важной мишенью для фармакологического вмешательства (Picollo et al., 2004; Liantonio et al., 2006, 2012; Imbrici et al. др., 2014). Активаторы ClC-K/barttin могут корректировать потерю функции каналов, несущих естественные мутации, связанные с синдромом Барттера или идиопатической глухотой. Блокаторы ClC-K/каналов бартина могут служить диуретиками или антигипертензивными препаратами.Однако существуют потенциальные побочные эффекты, которые следует тщательно изучить. Слух оказывается гораздо более чувствительным к активности ClC-K каналов (Riazuddin et al., 2009), чем функция почек. Хотя гемато-лабиринтный барьер защищает эпителий внутреннего уха от общего кровообращения (Juhn and Rybak, 1981), некоторые соединения, такие как салицилат, фуросемид или аминогликозидные антибиотики, легко влияют на функцию внутреннего уха. Кроме того, длительное наблюдение за пациентами, страдающими синдромом Барттера, выявило стойкую гиперренинемию, вторичный гиперальдостеронизм и развитие протеинурии у многих пациентов, даже если другие симптомы достаточно хорошо контролировались (Bettinelli et al., 2007). Поэтому возможные побочные эффекты фармакологических изменений в функции ClC-K должны быть тщательно проверены и могут даже препятствовать широкому клиническому использованию.

Миссенс-мутации, препятствующие экспрессии barttin, приводят к очень тяжелому почечному фенотипу (Janssen et al., 2009; Fahlke and Fischer, 2010; Nomura et al., 2011), часто с терминальной стадией почечной недостаточности в молодом возрасте. Поскольку др. мутации BSND , которые также отменяют образование функционального ClC-K/barttin, действительно сохраняют почечную функцию, возникает соблазн предположить, выполняют ли эти каналы дополнительные функции в почечных клетках.Успешное лечение этих редких случаев может потребовать лучшего понимания взаимодействия ClC-K с субъединицей barttin. Однако в настоящее время неясно, как барттин взаимодействует с каналами ClC-K, а также неясно, может ли это взаимодействие быть нацелено на изменение функции канала.

Outlook

Анионные каналы существуют во всех клетках человеческого тела и выполняют множество физиологических функций. Важность этих каналов подчеркивается генетическими вариантами, связанными с основными заболеваниями.Эволюция привела к множеству семейств анионтранспортных белков с очень разными функциями и физиологическими ролями. Семейство CLC в настоящее время является крупнейшим известным семейством генов, кодирующих анионные каналы и транспортеры, и многие аспекты функции CLC-каналов уже хорошо изучены. Функцию канала CLC изучали с помощью записи патч-клэмпа целых клеток и одного канала и флуоресцентной визуализации. Трехмерные структуры родственных белков позволили получить детальное представление о молекулярной архитектуре этих белков.Используя модели животных с нокаутом и нокаутом, мы можем изучать влияние функций CLC на клеточные процессы.

CLC-каналы функционально сильно отличаются от потенциалзависимых катионных каналов, и многие из этих особых свойств обусловлены их эволюцией от транспортеров. Многие вторично-активные транспортеры могут принимать режимы проскальзывания, подобные каналам (DeFelice and Goswami, 2007). Однако в семействе CLC претерпело довольно строгое разделение этих мод на антипортеры и каналы без транспортной активности.Молекулярные детерминанты этой дифференциации не ясны. В то время как замена одной аминокислоты (D136G) может преобразовать один канал, ClC-1, в канал со свойствами, очень похожими на ClC-2, еще не удалось преобразовать канал CLC в переносчик CLC. Каналы CLC привлекли большое внимание благодаря своей уникальной двуствольной конструкции. Мы до сих пор не понимаем молекулярных функций и физиологического воздействия этой любопытной конструкции. Как эти две субъединицы взаимодействуют друг с другом и каково физиологическое преимущество наличия двух более или менее синхронизированных пор?

Недавно предсказанная локализация ClC-1 в центральной нервной системе поднимает вопросы относительно потенциальной роли этого канала в этой системе органов.До сих пор неясно, как ClC-2 предотвращает нейродегенерацию и какую роль мутантный ClC-2 играет в повышенной возбудимости центральной нервной системы. ClC-Ka и -Kb являются важными фармакологическими мишенями, однако ни одно соединение, нацеленное на эти каналы, еще не вошло в клиническую практику. Возможное образование гетеродимерных каналов CLC со свойствами, сильно отличающимися от свойств гомодимерных каналов, также требует дальнейшего изучения. Хотя существует много знаний о хлоридной проводимости каналов CLC, возможно, стоит также изучить проникновение бикарбоната.Нам также не хватает полного молекулярного понимания того, как вспомогательные субъединицы, такие как barttin или GlialCAM, модифицируют CLC-каналы.

Изучение семейства CLC всегда было обусловлено как интересом к биофизическим свойствам, так и их физиологической значимостью. Последние 25 лет предоставили знания и инструменты для решения многих остающихся вопросов. Мы надеемся, что эта работа приведет к детальному пониманию молекулярной физиологии и патофизиологии этих каналов и может улучшить качество жизни многих пациентов с редкими или распространенными заболеваниями.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Функция и дисфункция CLC-каналов в норме и при патологии

Abstract

CLC-каналы и транспортеры экспрессируются в большинстве тканей и выполняют разнообразные функции. Существует четыре канала CLC человека, ClC-1, ClC-2, ClC-Ka и ClC-Kb, и пять транспортеров CLC, от ClC-3 до -7.Некоторые из каналов CLC дополнительно связаны с дополнительными субъединицами. В то время как barttin является обязательным для функциональной экспрессии ClC-K, GlialCam является факультативной субъединицей ClC-2, которая модифицирует гейтирование и, таким образом, увеличивает функциональную вариабельность внутри семейства CLC. Специфичные для изоформ ионная проводимость и свойства ворот оптимизируют отдельные каналы CLC для их клеточных задач. ClC-1 предпочтительно проводит при отрицательном напряжении, и получающееся в результате выпрямление внутрь обеспечивает большую проводимость хлорида в состоянии покоя без вмешательства в потенциал действия мышцы.Эксклюзивное открытие при напряжениях, отрицательных по отношению к потенциалу реверсии хлоридов, позволяет ClC-2 регулировать внутриклеточные концентрации хлоридов. ClC-Ka и ClC-Kb в равной степени подходят для входящих и исходящих токов для поддержки трансцеллюлярных потоков хлоридов. Каждый ген канала CLC человека был связан с генетическим заболеванием, и изучение этих мутаций предоставило много информации о физиологических ролях и молекулярных основах функции канала CLC. Мутации в гене, кодирующем ClC-1, вызывают врожденную миотонию, заболевание, характеризующееся повышенной возбудимостью сарколеммы и ригидностью мышц.Потеря функции каналов ClC-Kb/барттина ухудшает резорбцию NaCl в колене Генле и вызывает гипонатриемию, гиповолемию и гипотензию у пациентов, страдающих синдромом Барттера. Мутации CLCN2 были обнаружены у пациентов с расстройствами ЦНС, но функциональная роль этой изоформы до сих пор не выяснена. Недавние связи между ClC-1 и эпилепсией и ClC-Ka и сердечной недостаточностью предполагают новые клеточные функции этих белков. Этот обзор направлен на обзор знаний о физиологических и патофизиологических функциях каналов CLC человека в свете недавних открытий биофизических, физиологических и генетических исследований.

Ключевые слова:

Ключевые слова: канал CLC, анионный канал, патч-кламп, врожденная миотония, синдром Барттера, лейкенцефалопатия (1990) установили семейство CLC белков-транспортеров анионов (рис. 1). Семейство CLC включает девять белков CLC человека, от ClC-1 до -7, а также белки ClC-Ka и -Kb. Одноканальные записи на ClC-0 выявили унитарную проводимость около 10 пСм (Miller, 1982), и, поскольку это значение предсказывает скорость транспорта, намного превышающую максимальные скорости переносчиков и насосов, почти не оставалось сомнений в том, что этот белок опосредует диффузию анионов через мембрану. водные проводящие пути.Унитарные амплитуды тока ClC-1 и ClC-2 подтверждали эту идею (Pusch et al., 1994; Weinreich, Jentsch, 2001), так что изначально предполагалось, что все члены семейства представляют собой анионные каналы. Таким образом, стало неожиданностью, когда было показано, что бактериальный гомолог E. coli функционирует как сопряженный анион/протонный обменник (Accardi and Miller, 2004). Последовательный анализ транспортных механизмов изоформ CLC человека показал, что пять из девяти CLC человека, от ClC-3 до ClC-7, представляют собой анион-протонные обменники, а не анионные каналы (Picollo and Pusch, 2005; Scheel et al., 2005; Neagoe и др., 2010; Лейл и др., 2011; Гусман и др., 2013). Таким образом, семейство CLC объединяет две функциональные группы с термодинамически разными транспортными процессами. Все экспериментальные данные, представленные до сих пор, подтверждают близкое структурное сходство членов семейства CLC и демонстрируют, что транспортные белки схожей структуры могут специализироваться в ионных каналах или транспортерах.

Семейство транспортных белков CLC включает хлоридные каналы и обменники хлорид/протон.(A) Филограмма демонстрирует раннее разделение белков CLC человека на одну ветвь хлоридных каналов, охватывающую ClC-1, ClC-2, ClC-Ka и ClC-Kb. Антипортеры хлорида / протона включают ClC-3 до -7. Каналам ClC-K требуется субъединица barttin, в то время как ClC-7 зависит от присутствия Ostm1 для нормального функционирования. Недавно GlialCAM был идентифицирован как дополнительная субъединица ClC-2. (B) Вид димера cmClC [идентификатор PDB: 3ORG (Feng et al., 2010)] в виде ленты.Одна субъединица показана светло-серым, а другая субъединица показана цветом от начала B-спирали синим до карбоксиконца красным. Верхняя часть белка включает трансмембранное ядро, а нижняя красная часть содержит карбоксиконцы с доменами CBS. (C) Более близкий вид некоторых критических остатков, координирующих ионы хлорида в ecClC (идентификатор PDB: 1OTS). Остатки Y445 и S107, окрашенные в пурпурный цвет, отвечают за связывание хлорида (зеленая сфера) в S cen , а также предполагается, что они имеют решающее значение для медленного открытия каналов CLC.E148 представляет собой так называемый «запирающий глутамат», колеблющийся от S cen до S ext , и считается, что он активно участвует в быстром включении протопор каналов CLC.

CLC-каналы и транспортеры выполняют различные физиологические задачи. В то время как CLC-обменники в основном экспрессируются во внутриклеточных компартментах, таких как эндосомы или лизосомы, и, по-видимому, вносят вклад в регуляцию «домашнего хозяйства» этих органелл, CLC-каналы расположены в поверхностной мембране возбудимых и эпителиальных клеток и способствуют регуляции возбудимости мембраны, а также транспорт электролитов, воды и питательных веществ.В этом обзоре мы сосредоточимся исключительно на канальной ветви семейства CLC, резюмируя их функции, их клеточные роли и возможное участие в заболеваниях.

Молекулярная физиология каналов CLC

Структурные детерминанты функции канала CLC

До сих пор не сообщалось о трехмерной структуре высокого разрешения для канала CLC. Однако анион/протонные обменники CLC были кристаллизованы из нескольких прокариотических и эукариотических видов (Dutzler et al., 2002; Аккарди и др., 2006 г.; Лобет и Дутцлер, 2006 г.; Фэн и др., 2010; Робертсон и др., 2010 г.; Джаярам и др., 2011 г.; Лим и др., 2012). Поскольку структурные свойства транспортеров CLC хорошо передаются для исследований структурно-функциональных функций, выполненных на каналах CLC (Miller, 2003), обычно предполагается, что каналы CLC структурно очень похожи на транспортеры CLC.

Все белки CLC собраны в виде димеров, причем каждая субъединица имеет 18 трансмембранных спиралей (обозначенных от A до R), за которыми следует цитозольный карбоксиконец, содержащий два консервативных домена цистатионин-ß-синтазы (CBS) в эукариотических CLC (Bateman, 1997). ) (Фигура ).Каждая субъединица связывает анионы без участия других субъединиц — в полном согласии с двумя отдельными активными центрами, которые транспортируют анионы независимо в двух соседних субъединицах. Эта своеобразная архитектура уже была предложена на основе ранних одноканальных записей, которые демонстрировали два равноотстоящих состояния проводимости и предполагали существование двух путей ионной проводимости, так называемых протопор, для каждого отдельного канала CLC (Miller, 1982; Miller and White, 1984). ). Три отдельных сайта связывания хлоридов внутри каждой субъединицы были идентифицированы в трехмерных структурах, S int , S cen и S ext , названных в честь их положения относительно вне- или внутриклеточной стороны плазмы. мембрана.Центральное положение образует значительную часть фильтра селективности с консервативными аминокислотами S107, I109, F357 и Y445 в дополнение к менее консервативным F348 и I356 (рисунок; все положения даны для EcClC), которые координируют ион хлорида в пределах проводимости. пути (Dutzler et al., 2002, 2003; Lobet and Dutzler, 2006). Отсутствуют полные положительные заряды, например, от боковых цепей аргинина или лизина, участвующих в формировании сайтов связывания анионов, что согласуется с представлением о том, что белки CLC используют спиральные дипольные моменты для создания положительного электростатического потенциала, необходимого для анионной селективности (Dutzler et al., 2002; Гуо и Маккиннон, 2005).

Отдельные структуры переносчиков CLC демонстрируют сходную складку остова, но, по-видимому, представляют разные конформации цикла обмена Cl /H + . Сравнение этих конформаций показывает движение консервативной боковой цепи глутамата, E148 в EcClC (рис. ), изнутри наружу пути проведения, переключающегося с S cen на S ext . Такие движения зависят от статуса протонирования и, вероятно, объясняют перенос протонов в стехиометрии от 2 Cl до 1 H + (Dutzler et al., 2003; Аккарди и Миллер, 2004 г.; Фэн и др., 2010; Пиколло и др., 2012).

Известно, что два карбоксиконцевых домена CBS эукариотических каналов CLC взаимодействуют и образуют внутримолекулярные димерные комплексы. Частичное удаление доменов CBS может вызвать либо потерю функции, либо изменения в закрытии каналов или внутриклеточном распределении (Maduke et al., 1998; Estévez et al., 2004; Hebeisen et al., 2004; Hebeisen and Fahlke, 2005; Гарсия-Оливарес и др., 2008). Недавняя структура эукариотического транспортера CLC предполагает взаимодействие между доменами CBS и внутриклеточными полюсами спиралей D и R.Поскольку эти спирали содержат боковые цепи серина и тирозина, координирующие S cen (S107 и Y445 в EcClC), это взаимодействие обеспечивает структурную основу для регуляции функции CLC с помощью кларбоксиль-концевых доменов (Hebeisen and Fahlke, 2005; Feng et al. , 2010). Дополнительные межсубъединичные взаимодействия димеров CBS наблюдались in vitro для изолированных карбокси-концов ClC-5 и ClC-Kb (Meyer et al., 2007; Martinez and Maduke, 2008). Такие взаимодействия могут играть роль в межсубъединичной коммуникации и могут способствовать кооперативным гейт-процессам (Быкова и др., 2006).

Функциональные свойства каналов CLC в экспериментах по фиксации напряжения

Гетерологическая экспрессия каналов CLC в ооцитах Xenopus и клетках млекопитающих позволила провести детальный функциональный анализ всех каналов CLC человека. На рисунке показаны записи пэтч-клэмп цельных клеток из клеток HEK293, сверхэкспрессирующих каналы CLC человека, и иллюстрируется функциональное разнообразие этих различных белков. Для всех записей клетки подвергались почти симметричному распределению хлорида поперек плазматической мембраны, держались на уровне 0 мВ, и применялись скачки напряжения в широком диапазоне.

Записи пэтч-клэмп цельных клеток демонстрируют функциональную изменчивость каналов CLC человека. (A-D) Репрезентативные токовые ответы клеток HEK293T, экспрессирующих ClC-1, ClC-2, ClC-Ka/barttin или ClC-Kb/barttin, на указанные протоколы напряжения (левый столбец). В правом столбце показаны зависимости от напряжения вероятностей открытия быстрых протопор (темные кружки) и медленных общих ворот (светлые кружки), а также вероятности того, что канал будет проводящим (жирная линия).Запись ClC-1 воспроизведена из Weinberger et al. (2012), в то время как записи ClC-Ka и -Kb были воспроизведены из Riazuddin et al. (2009).

В то время как амплитуды тока ClC-Ka/barttin и ClC-Kb/barttin почти не зависят от времени, скачки напряжения приводят к зависимой от времени и напряжения релаксации амплитуды тока ClC-1 и ClC-2, которую можно использовать для кинетический анализ ворот канала. Изменения макроскопической амплитуды тока обычно следуют сумме двух экспоненциальных функций с отдельными временными константами.Две константы времени активации и деактивации обусловлены существованием двух воротных механизмов, которые либо действуют на отдельные протопоры, либо совместно на оба протопора (Miller, 1982). Во всех CLC-каналах млекопитающих открытие протопор примерно в 10 раз быстрее, чем обычное открытие (Miller, 1982; Saviane et al., 1999; Fischer et al., 2010; Stölting et al., 2013), что привело к синонимическому использованию термины быстрые/протопоровые ворота и медленные/общие ворота. Для многих каналов эти кинетические различия использовались для разделения двух процессов при записи макроскопических токов.Мгновенная амплитуда тока в хвостовом импульсе фиксированного напряжения переводится в относительную вероятность открытого канала в конце предшествующего испытательного напряжения (Hodgkin and Huxley, 1952). Вставка короткого тестового импульса в напряжение, при котором два процесса стробирования достаточно различаются по скорости, только манипулирует быстрым стробом и, таким образом, эффективно фиксирует его с одинаковой вероятностью открытия для всех предыдущих шагов напряжения. Такой подход позволяет измерять зависимость медленного стробирования от напряжения изолированно.Если предположить, что процессы быстрой и медленной селекции независимы, вероятность открытия быстрых ворот может быть рассчитана как отношение общей вероятности открытия канала к проценту открытых медленных ворот (Accardi and Pusch, 2000).

Хлоридный канал ClC-1 скелетных мышц (рис. ) открыт при 0 мВ, с быстрыми и медленными воротами, которые оба активируются деполяризацией мембраны (Accardi and Pusch, 2000). График зависимости амплитуды тока от мембранного потенциала показывает проводимость внутреннего выпрямления (Fahlke et al., 1995). Повсеместно экспрессируемый ClC-2 закрывается при положительном потенциале и активируется в течение очень медленного времени при гиперполяризации мембраны (рис. 1) (De Santiago et al., 2005). Запуск ClC-2 снова характеризуется двумя кинетически различными процессами ворот, которые оба активируются гиперполяризацией, а не деполяризацией, как в ClC-1. Как ClC-1, так и ClC-2 демонстрируют сильно выпрямляющие макроскопические амплитуды тока внутрь, но с другой механистической основой. Выпрямление каналов ClC-1 внутрь происходит из-за зависящей от напряжения унитарной проводимости, которая уменьшается при положительном напряжении примерно до 10% от проводимости при отрицательном потенциале (Pusch et al., 1994; Фальке и др., 1995; Рычков и др., 1998; Штёльтинг и др., 2014). Напротив, унитарные проводимости тока ClC-2 не зависят от напряжения, а выпрямление токов ClC-2 происходит из-за зависящего от напряжения стробирования, которое закрывает быстрый затвор при положительном напряжении до 0 мВ (Stölting et al., 2013).

ClC-Ka (рис. ) и ClC-Kb (рис. ) могут функционально экспрессироваться только вместе с дополнительной субъединицей барттина (Estévez et al., 2001; Waldegger et al., 2002; Scholl et al., 2006; Fischer et al. др., 2010). В клетках млекопитающих токи ClC-Kb/барттина не зависят от времени с небольшим двунаправленным выпрямлением. Напротив, каналы ClC-Ka/barttin очень быстро закрываются при переходе к отрицательному напряжению до -100 мВ. Эти очень быстрые процессы, вероятно, соответствуют быстрому закрытию протопор в этих каналах (Riazuddin et al., 2009; Fischer et al., 2010). При экспрессии в ооцитах ClC-Ka/barttin и ClC-Kb/barttin обнаруживают резко различающиеся свойства гейтирования (Imbrici et al., 2014). В то время как абсолютные открытые вероятности ClC-Ka/barttin близки к 1 в клетках млекопитающих (Riazuddin et al., 2009), соответствующие значения очень малы в ооцитов Xenopus (Gradogna et al., 2010). Более того, ClC-K каналы, экспрессируемые в клетках млекопитающих, часто реагируют на фармакологическую модификацию иначе, чем каналы, экспрессируемые в ооцитах Xenopus (Imbrici et al., 2014). Причина этих функциональных различий пока не ясна. Могут быть еще неизвестные партнеры взаимодействия ClC-K/barttin, которые присутствуют в одной системе экспрессии, но не присутствуют в другой. Альтернативно, функциональные свойства каналов ClC-K/barttin могут зависеть от состава липидов.Хотя экспрессия в клетках млекопитающих, по-видимому, больше похожа на почечные клетки, чем на ооциты амфибий, в настоящее время невозможно судить, какой из двух различных биофизических и фармакологических фенотипов ближе к функциональным свойствам нативных каналов.

Хлорид, безусловно, является наиболее распространенным анионом in vivo , что также привело к обозначению каналов CLC как «хлоридных» вместо «анионных». Следует отметить, что фильтр селективности каналов CLC не позволяет точно различать различные виды анионов, рассматриваемых как проницаемость для других (нефизиологических) анионов, таких как I , F , SCN , NO . 3 или Br .Однако исследования с использованием другого распространенного физиологического аниона, HCO 3 , проводятся редко. Значительная проницаемость для бикарбоната была обнаружена в исследованиях ClC-5 в ооцитах Xenopus laevis (Mo et al., 1999), а математическое исследование потоков эпителиальных ионов в восходящем колене Генле предсказывает, что значительная бикарбонатная проводимость ClC- Kb необходим для правильной функции почек (Weinstein, 2010).

Двухствольные каналы CLC демонстрируют уникальные свойства одиночного канала

В настоящее время существуют одноканальные записи для большинства каналов CLC человека (рис. ) (Saviane et al., 1999; Фишер и др., 2010; Вайнбергер и др., 2012 г.; Штёльтинг и др., 2013). Таким образом, при анализе записей с мембранных участков, содержащих только один канал CLC, график амплитудной гистограммы показывает в общей сложности три пика, соответствующие закрытому каналу или открытию одной или двух протопор (правая сторона рисунков). Это свойство является результатом уникальной димерной архитектуры каналов CLC с двумя путями ионной проводимости.

Записи отдельных каналов или анализ шума записей целых ячеек предоставляют свойства отдельных каналов CLC.(A–D) 90 010 Репрезентативные одноканальные записи гомодимерного ClC-1, гомодимерного ClC-2, гетероконкатамерного ClC-1-ClC-2, а также ClC-Ka, коэкспрессированного с бартином. Все записи гомодимерных каналов показывают два отдельных открытых состояния, представляющих одну или две одновременно открытые протопоры. ClC-Ka/barttin демонстрирует высокую вероятность открытия, приближающуюся к 1, поэтому наблюдается мало отклонений от полностью открытого состояния. (A–C) были воспроизведены и изменены из Stölting et al. (2014) и (D) от Riazuddin et al.(2009). (E) Репрезентативный график среднего тока и дисперсии клеток HEK293T, экспрессирующих человеческий канал ClC-1 с заменой цистеина 277 на тирозин. Протокол напряжения (вверху), средний ток (в центре) и дисперсия (внизу) получены при pH 5,9, чтобы увеличить вероятность открытия каналов, содержащих этот конкретный мутант. (F) Построение графика отклонения от среднего тока не приводит к простому параболическому распределению. Как и ожидалось, для двухствольных каналов с отдельными протопорами и совместными воротами все точки данных попадают между теоретическим прогнозом для каналов с постоянно открытыми общими воротами (обозначаемыми как «i») или постоянно открытыми воротами протопор (обозначаемыми как «2i»).Переход от одной параболы (штриховая линия) к другой (линия) указывает на медленный переход быстрых ворот из закрытого состояния в открытое во время записи. (G) Линейное преобразование графика в (F) облегчает идентификацию изменений вероятности открытия быстрых ворот. (E-G) были воспроизведены и изменены из Weinberger et al. (2012).

Одноканальные записи прототипа ClC-0 выявили длительные периоды с закрытыми каналами, которые прерывались фазами, в которых обе протопоры быстро переключались между открытым и закрытым состояниями.Во время этих взрывоподобных фаз распределение вероятности встречи с любым из трех уровней амплитуды определяется почти исключительно быстрыми воротами протопор, тогда как длительные закрытые длительности основаны на медленных общих воротах. Поскольку индивидуальная фиксация протопор не зависит от соседней субъединицы, время, проведенное на каждом из трех уровней тока, распределяется биномиально, и такое поведение было названо «биномиальными всплесками» (Miller, 1982). ClC-1 и ClC-2 демонстрируют гейт-процессы, которые напоминают поведение ClC-0, с быстрым гейтированием протопор и медленными кооперативными процессами (рисунки) (Saviane et al., 1999; Аккарди и Пуш, 2000 г.; Суньига и др., 2004). Barttin, по-видимому, блокирует кооперативные ворота в открытой конформации, так что одноканальные записи каналов ClC-Ka/barttin показывают исключительно четное число протопор с независимыми воротами (Fischer et al., 2010). До сих пор не сообщалось об одноканальных записях в гетерологичных системах экспрессии для ClC-Kb.

Анализ гетеродимерных каналов, состоящих из одной субъединицы ClC-1 и одной субъединицы ClC-2, позволил по-новому взглянуть на молекулярную основу медленных кооперативных ворот (Stölting et al., 2014). В таких гетеродимерных каналах отсутствуют кооперативные ворота, но сохраняются два отдельных механизма быстрого и медленного входа для каждой протопоры. В гетеродимерах ClC-1-ClC-2 быстрое открытие протопор ClC-1 напоминает соответствующие процессы в гомодимерах ClC-1. Однако протопора ClC-1 удерживается закрытой при положительном потенциале с помощью новых медленных ворот, которые допускают только временные открытия в гетеродимерной сборке. Напротив, протопора ClC-2 активна при всех потенциалах и находится под контролем быстрых и медленных воротных процессов, которые кинетически отличаются от тех, которые идентифицированы для протопоры ClC-1.В одноканальных записях такое поведение приводило только к одному состоянию проводимости, соответствующему протопоре ClC-2 (рис. ). Эти результаты указывают на то, что общие ворота каналов CLC, в конечном счете, возникают из-за конформационных изменений внутри индивидуального протопора (Bennetts and Parker, 2013; Stölting et al., 2014). Гомодимеризация позволяет синхронизировать эти процессы и общий гейт. В гетеродимерах эта координация нарушена, так что медленные этапы ворот больше не являются кооперативными.

Амплитуды одного канала для протопора ClC-2 были значительно меньше в гетероконкатамерах, чем в гомодимерах ClC-2 (рис. ). В совокупности эти эксперименты демонстрируют, насколько тесно взаимодействуют две субъединицы в рамках одного индивидуального канала. Затвор и проникновение через каждый транспортный белок регулируется электростатическими взаимодействиями между заряженными боковыми цепями или спиральными дипольными моментами. Можно предположить, что изменения в ориентации определенных боковых цепей или спиралей посредством межсубъединичных взаимодействий могут регулировать электростатическое поле соседней субъединицы CLC и, таким образом, кооперативно детерминировать ворота и проникновение.

Анализ шума представляет собой альтернативный метод определения свойств отдельных каналов (Sigworth, 1980). Это особенно полезно для каналов с малой амплитудой унитарного тока и часто помогает коррелировать унитарные и макроскопические токи определенных ионных каналов. Такой анализ основан на предположении, что основные процессы стробирования являются стохастическими событиями и что небольшие отклонения в макроскопической амплитуде тока вызваны флуктуациями числа открытых каналов.В то время как текущий шум, создаваемый каналами только с одним уровнем проводимости, легко анализировать, двуствольная архитектура каналов CLC требует модификации такого анализа шума (Fischer et al., 2010; Weinberger et al., 2012).

Скачки напряжения вызывают релаксацию вероятности открытия зависимых от напряжения каналов от предыдущего равновесного значения к новому и приводят к зависящим от времени изменениям амплитуды тока. Во время этих токовых релаксаций амплитуда тока одного канала постоянна, тогда как количество открытых каналов изменяется.Повторная выборка откликов тока на один и тот же скачок напряжения (рисунок ) позволяет определить средний ток по всем зарегистрированным скачкам напряжения и средние отклонения для нескольких моментов времени после скачка напряжения. Для каналов только с одним состоянием проводимости график дисперсии тока (σ 2 ) по сравнению со средней амплитудой < I > (рис. ) дает параболическое распределение, которое зависит от: амплитуды одного канала ( i ) и количество каналов ( N ).

σ2=  i〈I〉−(〈I〉2N)

или после линеаризации делением дисперсии на ток

Некоторые CLC-каналы показывают значительное отклонение от этой теории, которое становится еще более очевидным после линеаризации параболического графика ( цифры). В основе этого своеобразного соотношения ток-дисперсия лежит двуствольная архитектура этих каналов. Взятие двух протопор с двумя структурно и кинетически различными процессами ворот позволяет удовлетворительно количественно оценить это поведение.Макроскопический ток каналов ХЖК определяется как произведение вероятности открытия каждых ворот, количества каналов и удвоенной амплитуды одиночной протопоры: P ( T ( T ) · P C ( T ( T )

Текущий дисперсию зависит от количества каналов ( N ), единственная амплитуда протопора ( I ) и зависящие от времени вероятности открытия для быстрых протопоровых ворот ( P p ( t )) и медленных общих ворот ( P c ( t )):

6 ) = N · 2 I · 2 I 2 · P P P ( T ) · P C ( T ) · (1 — 2 P р ( т ) ·  9 0005 P c ( t ) + P p ( t ))

Эти уравнения можно упростить до:

σ2=  (1+Pp(t))·i〈I〉−(〈I〉2N)

демонстрируя, что эта количественная обработка позволяет определить амплитуду одного канала, если известна одна из двух открытых вероятностей.Даже если график дисперсии тока не показывает очевидных отклонений от параболической формы, необходимо учитывать зависимость начального наклона от минимальной вероятности открытия протопоровых ворот ( P p ).

Во всех случаях текущая дисперсия должна находиться между двумя крайними значениями:

I〉22N)             для Pc(t)=1

Используя такой анализ, мы продемонстрировали, что мутация C277Y, вызывающая миотонию, приводит к значительному снижению вероятности медленного открытия ворот (Weinberger et al., 2012). Предполагая, что максимальное значение, равное удвоенному наименьшему определенному соотношению дисперсии/текущего тока, эти результаты также продемонстрировали уменьшенные амплитуды одного канала по сравнению с ClC-1 дикого типа из одноканальных записей. Это открытие является довольно неожиданным, поскольку С277 не участвует в формировании проводящего пути в известных трехмерных структурах. Это обеспечивает дополнительную поддержку понятия тесного взаимодействия субъединиц в определении свойств ворот и проникновения CLC-каналов.

Молекулярные детерминанты функции канала CLC

За последние 20 лет сочетание сайт-направленного мутагенеза и функционального анализа мутантных каналов позволило понять механизмы и детерминанты последовательности ворот канала CLC и проникновения анионов. Эксперименты по сайт-направленному мутагенезу на нескольких каналах CLC продемонстрировали, что один и тот же консервативный глутамат в начале спирали F, движение которого необходимо для транспорта протонов в антипортерах CLC, важен для быстрого запуска в ClC-0, ClC-1 и ClC-2. (Фальке и др., 1997; Дутцлер и др., 2003 г.; Нимейер и др., 2003; De Santiago et al., 2005) и поэтому был назван «запирающим глутаматом». В каналах ClC-K этот «запирающий глутамат» заменяется валином, поэтому часто предполагается, что ClC-Ka и ClC-Kb не имеют протопорных затворов. Тем не менее, одноканальные записи от ClC-Ka/barttin выявили короткие события стробирования и очень высокую вероятность открытия канала (Riazuddin et al., 2009; Fischer et al., 2010). Было обнаружено, что время, проведенное в открытом и закрытом состояниях, распределяется биномиально, а самый высокий наблюдаемый уровень проводимости всегда был кратным двум, демонстрируя, что наблюдаемые переходы открытия и закрытия вызваны отдельными воротами протопор без вмешательства постоянно открытых общих ворот (Riazuddin). и другие., 2009; Фишер и др., 2010). Гомологичный крысиный ClC-K1 также функционален в отсутствие бартина и, таким образом, дает возможность более подробно изучить влияние бартина на функцию ClC-K. В отсутствие бартина в rClC-K1 проявляются протопоры и общие вентильные процессы с противоположной зависимостью от напряжения. Совместная экспрессия с бартином приводит к постоянному открытию общих ворот, опять же, как показано биномиальным распределением гистограмм амплитуды для каждого состояния проводимости при совместной экспрессии с бартином (Fischer et al., 2010). Хотя результаты подразумевают, что боковые цепи, отдельные от исходного «запирающего глутамата», должны быть вовлечены в затвор протопор, точная молекулярная основа такого затвора еще не идентифицирована в каналах ClC-K.

В ClC-0, ClC-1 и ClC-2 цистеин находится рядом с интерфейсным доменом и в непосредственной близости от S ext (C212 в ClC-0, C277 в ClC-1 или C258 в ClC-2) играет решающую роль в медленном кооперативном гейтировании (Lin et al., 1999; Accardi et al., 2001; Zúñiga et al., 2004; Де Сантьяго и др., 2005 г.; Вайнбергер и др., 2012). Опять же, в каналах ClC-K отсутствует цистеин в этом положении, что позволяет предположить, что эта боковая цепь не требуется для общего управления воротами. Основываясь на трехмерных структурах CLC-антипортеров, недавно было высказано предположение, что медленное совместное запирание ClC-0 и ClC-1 зависит от остатка тирозина, который координирует центральный сайт связывания хлорида (Bennetts and Parker, 2013). Считается, что этот тирозин взаимодействует с глутаматом селектора в качестве последнего шага медленного селектора, чтобы закупорить или открыть пору.Однако до сих пор неизвестно, каким образом общие ворота одновременно передаются обеим протопорам. Неизвестно даже, находятся ли антипортеры в семействе CLC под контролем кооперативного воротного механизма. Однако на основании предыдущих исследований кажется разумным, что перегруппировка карбокси-конца может потребоваться для кооперативного гейтирования (Bykova et al., 2006; Garcia-Olivares et al., 2008; Ma et al., 2011; Stölting et al. ., 2013).

Преобразование антипортеров CLC в каналы/унипортеры

Для понимания структурных особенностей, отличающих анионный канал CLC от анион-протонного обменника, были предприняты попытки преобразовать антипортеры CLC в анионные каналы или наоборот.Однако пока эти попытки не увенчались полным успехом. Замена остатка глутамата («затворный глутамат» E148 в EcClC) в спирали F на аланин отменяет вторично-активный транспорт и делает возможным пассивное проникновение анионов (Accardi and Miller, 2004; Jayaram et al., 2008). Соответствующий обмен также устранил связь транспорта протонов с потоком хлорида в человеческих анион/протонных антипортерах ClC-4 и ClC-5 (Picollo and Pusch, 2005; Scheel et al., 2005). Другой остаток глутамата в EcClC (E203) также может быть нейтрализован заменой на аланин, чтобы нарушить связь транспорта хлоридов и протонов, что приведет к переключению на каналоподобный фенотип, возможно, из-за отсутствия внутреннего сайта связывания протонов (Accardi и другие., 2005). Некоторые замены центрального тирозина (Y445 в EcClC) также приводили к кажущемуся канальному фенотипу с сильным уменьшением наблюдаемой плотности анионов для S cen в сопутствующих рентгеновских кристаллических структурах (Accardi et al., 2006). Мутация E148 вместе с Y445 увеличивала транспорт унитарных анионов в EcClC выше значений, наблюдаемых для унипортеров, однако наблюдаемые скорости проводимости были значительно ниже соответствующих значений в каналах CLC (Jayaram et al., 2008). Следует отметить, однако, что все эти остатки в основном сохраняются даже в канальной ветви семейства CLC, что дает важную информацию о процессе проводимости анионов и протонов, но не позволяет продемонстрировать фактическую разницу между транспортерами и каналами из одного и того же семья.Сообщений о преобразовании канала CLC в антипорт пока нет.

Клеточная физиология и патофизиология каналов CLC

CLC-1

Скелетные мышцы взрослых уникальны среди возбудимых тканей благодаря высокой проводимости хлоридов в покое. Он превышает сарколеммальную калиевую проводимость более чем в четыре раза и настолько высок, что изменения внеклеточных концентраций хлоридов не изменяют потенциал покоя, а скорее приводят к изменениям внутриклеточного [Cl ] до тех пор, пока равновесный потенциал ионов хлора снова равняется потенциалу покоя мышц (Hodgkin and Horowicz, 1959; Bretag, 1987).Физиологическая роль ClC-1 стала ясна при изучении патофизиологии врожденной миотонии, редкого состояния человека, характеризующегося ригидностью мышц при резких резких движениях (Bryant and Morales-Aguilera, 1971; Adrian and Bryant, 1974). В миотонических мышечных волокнах мембранный потенциал не полностью реполяризуется после серии потенциалов действия во время произвольных сокращений, что приводит к так называемой постдеполяризации. Постдеполяризации могут приводить к длительной электрической активности мышечных волокон даже после прекращения активности нейронов и, таким образом, являются электрофизиологической основой ригидности мышц (Adrian and Bryant, 1974).Временной ход самого потенциала действия не изменяется в мышечных волокнах миотонической козы, что указывает на то, что ClC-1 не способствует реполяризации самого потенциала действия (Bryant, 1973).

Последеполяризация миотонических мышечных волокон происходит из-за накопления K + в Т-трубочках, что происходит как в нормальных, так и в миотонических мышцах во время повторяющихся потенциалов действия. В нормальных скелетных мышцах высокая проводимость хлоридов в состоянии покоя снижает константу длины сарколеммы и предотвращает распространение этой деполяризации вдоль сарколеммы.В отсутствие шунтирующей сарколеммальной хлоридной проводимости в миотонической мышце деполяризация t-трубочек приводит к деполяризации мембраны сарколеммы, вызывая устойчивую активность мышечного волокна. До сих пор ведутся споры о том, обеспечивает ли ClC-1 свою шунтирующую проводимость только через каналы, локализованные вдоль наружной сарколеммальной мембраны или также вдоль t-трубочек. Недавнее исследование представило доказательства однородного распределения в Т-трубочках и мембране сарколеммы (DiFranco et al., 2011), в то время как в другой статье описывается эксклюзивная экспрессия в поверхностной мембране (Lueck et al., 2010). Независимо от точной локализации, хлоридные каналы в мышцах позволяют волокнам скелетных мышц электрически переносить инвагинации t-тубулярной мембраны и последующее накопление калия (Рисунки).

ClC-1 является основным хлоридным каналом в мышцах. (A) В скелетных мышцах мембранный потенциал покоя определяется градиентом калия через сарколеммальную и Т-трубчатую мембраны.Потенциалы действия приводят к открытию кальциевых каналов L-типа (DHPR), которые, в свою очередь, открывают внутриклеточные каналы (RyR), высвобождающие кальций из саркоплазматического ретикулума, необходимый для сокращения мышцы. (B) Последовательность потенциалов действия приводит к перемещению калия через каналы во внеклеточную сторону. Поскольку диффузия ионов из Т-трубочек идет медленно, калий накапливается и вызывает временные изменения калиевого реверсивного потенциала, которые, однако, компенсируются высокой проводимостью сарколеммального хлорида. (C) В мышечных волокнах, экспрессирующих дисфункциональные каналы ClC-1, деполяризация t-трубочек распространяется на поверхностную мембрану и может запускать спонтанную генерацию новых потенциалов действия даже после окончания произвольного движения. Эта «последеполяризация» отмечена красным. (D) Репрезентативные записи мутантных каналов ClC-1, несущих болезнетворные мутации, иллюстрирующие разнообразные результаты замены отдельных аминокислот при гейтировании ClC-1.

ClC-1 был клонирован из скелетных мышц как первый член семейства CLC млекопитающих (Steinmeyer et al., 1991). Мутации в CLCN1 как генетическая основа врожденной миотонии доказали, что ClC-1 действительно представляет собой хлоридный канал взрослых скелетных мышц (Koch et al., 1992; George et al., 1993). ClC-1 демонстрирует внутреннюю проводимость унитарного тока при симметричных концентрациях хлоридов со значением примерно на 1,5 пСм ниже -85 мВ и в 10 раз более низкую проводимость при напряжениях, положительных по отношению к потенциалу обращения хлоридов (Pusch et al., 1994; Stölting et al. др., 2014). ClC-1 имеет открытую вероятность 0.38 при -85 мВ (Weinberger et al., 2012) и минимально открывается только во время подъема потенциала действия, что быстрее, чем время активации ClC-1 (Fahlke and Rüdel, 1995; Accardi and Pusch, 2000; Hebeisen). и Фальке, 2005). Эти специфические свойства анионной проводимости и гейтирования делают ClC-1 идеально подходящим для обеспечения большой проводимости хлорида в состоянии покоя с минимальным вмешательством в потенциал действия. Эти свойства сводят к минимуму приток Na + во время потенциала действия и, таким образом, снижают потребление АТФ после продолжительной мышечной активности, которая необходима для активной экструзии Na + с помощью Na + /K + -АТФазы.

Хотя потенциал-зависимое гейтирование ClC-1 не является строго необходимым для его физиологической функции, почти все болезнетворные мутации, которые были изучены, нарушают гейтирование канала [за заметным исключением G230E, который влияет на проникновение ионов и селективность ClC-1 (Фальке и др., 1997)]. Первая мутация миотонии, которая была функционально проанализирована, D136G (рис. 1), связывает открытие канала с внутриклеточной концентрацией хлорида и, таким образом, инвертирует зависимость ClC-1 от напряжения (Fahlke et al., 1995). D136G hClC-1 открывается только при напряжении ниже равновесного потенциала хлорида. Отток хлоридов при таких напряжениях будет снижать внутриклеточную концентрацию хлоридов до достижения потенциала реверсии хлоридов, подобного потенциалу покоя сарколеммы. При этом [Cl ] D136G hClC-1 будет постоянно закрыт, что полностью согласуется с низкой проводимостью хлоридов в покое и повышенной возбудимостью. D136G hClC-1 напоминает ClC-2 по многим свойствам и, таким образом, иллюстрирует важность специфичной для изоформ специализации внутри семейства CLC.Впоследствии было идентифицировано несколько мутаций, которые сместили кривую активации ClC-1 в сторону более деполяризованных потенциалов (Pusch et al., 1995; Rhodes et al., 1999; Wu et al., 2002) (рис. 1). Такие сдвиги уменьшают открытую вероятность hClC-1 при -85 мВ и, таким образом, снижают проводимость хлорида в покое. Сходное изменение ворот канала лежит в основе миотонии у коз (Beck et al., 1996). Другие мутации приводят к изменениям ворот, так что два процесса ворот развивают противоположный паттерн зависимости от напряжения, один стимулируется деполяризацией мембраны, а другой гиперполяризацией, как в каналах T550M ClC-1 (Warnstedt et al., 2002; Ву и др., 2002; Вайнбергер и др., 2012). За последние два десятилетия у пациентов с врожденной миотонией было обнаружено большое разнообразие болезнетворных мутаций. Эти мутации распространены по всей кодирующей области ClC-1, и их функциональный анализ дал много важных сведений о последовательностях, определяющих функцию канала CLC (Fahlke et al., 1995, 1997; Wollnik et al., 1997; Saviane et al. ., 1999; Richman et al., 2012; Weinberger et al., 2012; Lee et al., 2013).

Недавно новый вариант ClC-1 был идентифицирован экзономическим секвенированием у пациентов, страдающих идиопатической эпилепсией (Chen et al., 2013). Это исследование также показало транскрипты мРНК ClC-1 и белковые полосы, окрашенные антителами против ClC-1 в частях головного мозга человека. Эта новая роль и локализация ClC-1 может привести к новым перспективам физиологии каналов CLC в центральной нервной системе. Однако отсутствие центральных неврологических симптомов у пациентов с врожденной миотонией или у животных, моделирующих это заболевание, поднимает вопрос о том, как функциональные изменения ClC-1 могут способствовать развитию эпилепсии.

CLC-2

ClC-2 был обнаружен вскоре после ClC-1 как в возбудимых, так и в невозбудимых клетках (Thiemann et al., 1992). ClC-2 демонстрирует независимую от напряжения проводимость одного канала всего ~ 2,4 пСм на протопору (Stölting et al., 2013). Он закрывается при положительных потенциалах и активируется в течение очень медленного времени при гиперполяризации. После активации при отрицательных потенциалах напряжение возвращается к положительным потенциалам, что приводит к очень медленной деактивации тока. В то время как протопорные ворота полностью закрываются при положительных потенциалах, медленные общие ворота демонстрируют минимальную вероятность открытия значительно выше нуля (De Santiago et al., 2005; Гарсия-Оливарес и др., 2008). Сходные особенности гейтирования наблюдались в ооцитах Xenopus и в клетках млекопитающих, однако кинетика активации и деактивации была значительно медленнее в ооцитах. Кинетика гейтирования модифицируется связыванием нуклеотидов с карбокси-концом (Dhani et al., 2008; Stölting et al., 2013) и составом окружающих липидов (Hinzpeter et al., 2007). Также было обнаружено, что активация и деактивация ClC-2 значительно ускоряются делециями или модификациями карбокси- или амино-концевых доменов, что предполагает участие больших перестроек этих белковых доменов (Garcia-Olivares et al., 2008; Сен-Мартен и др., 2009 г.; Stölting et al., 2013), например, для ClC-0 и ClC-1 (Быкова и др., 2006; Ma et al., 2011).

Запирание ClC-2 зависит от внутриклеточного [Cl ], так что открытие канала происходит только при потенциалах, отрицательных по отношению к равновесному потенциалу Cl (Niemeyer et al., 2004). В клетках, в которых мембранный потенциал ограничен каналами различной селективности в сторону более отрицательных потенциалов, можно предположить, что ClC-2 будет оставаться открытым и обеспечивать отток анионов до тех пор, пока равновесный потенциал хлоридов не сравняется с мембранным потенциалом.Таким образом, ClC-2 может способствовать регуляции внутриклеточных концентраций анионов в нейронах, глии или оттоку хлоридов в эпителиальных клетках. Ранние исследования ClC-2, гетерологически экспрессируемого в ооцитах Xenopus , выявили активацию с помощью осмотических градиентов, подтверждая, что ClC-2 может быть вовлечен в клеточный осмотический гомеостаз (Gründer et al., 1992). Однако функциональные свойства ClC-2 явно отличаются от активируемых объемом анионных каналов (Nilius et al., 1997), а клетки, лишенные ClC-2, демонстрируют неизмененные активируемые объемом анионные потоки (Nehrke et al., 2002).

ClC-2 может собираться с дополнительными субъединицами, которые не требуются для функции ClC-2, а скорее определяют субклеточную локализацию и модифицируют селекцию канала в различных типах клеток. Первой описанной вспомогательной субъединицей ClC-2 был белок cereblon, который связывается с карбокси-концом ClC-2 и предположительно регулирует экспрессию функциональных каналов в сетчатке (Hohberger and Enz, 2009). Совсем недавно было показано, что новая субъединица под названием GlialCAM (синоним более раннего обозначения HepaCAM) связана с ClC-2 (Jeworutzki et al., 2012). GlialCAM представляет собой белок длиной 416 аминокислот с одним трансмембранным доменом и большим Ig-подобным аминоконцевым доменом V- и C2-типа. В гетерологичных системах экспрессии совместная экспрессия GlialCAM с ClC-2 переключала фенотип в сторону почти конститутивно открытого канала. Хотя GlialCAM взаимодействует только с ClC-2 in vivo из-за его специфичной для клеток экспрессии, было обнаружено, что он связывается с несколькими каналами CLC in vitro , такими как ClC-0, ClC-1 и ClC-K/barttin влияющие на локализацию и общие параметры ворот (Jeworutzki et al., 2014).

Токи ClC-2, записанные на срезах головного мозга животных, нокаутированных по GlialCAM, не сильно отличаются от соответствующих следов, полученных у животных дикого типа, что позволяет предположить, что GlialCAM не оказывает такого резкого эффекта на вход канала в нативных клетках, как в гетерологичной системе экспрессии ( Hoegg-Beiler и др., 2014). Работа над мышами с нокаутом MLC1 также показала, что MLC1, мембранный белок с неизвестной функцией, ассоциированный с мегалэнцефальной лейкоэнцефалопатией (Leegwater et al., 2001), может стабилизировать GlialCAM в плазматической мембране и, таким образом, действовать как дополнительный партнер по связыванию в комплексе ClC-2/GlialCAM (Hoegg-Beiler et al., 2014).

Среди наиболее понятных функций ClC-2 является отток хлоридов через базолатеральную мембрану в желудочно-кишечный тракт, облегчающий реабсорбцию NaCl и впоследствии H 2 O (рис. ) (Catalán et al., 2002, 2004). Предполагаемый активатор ClC-2, лубипростон, улучшает течение хронического идиопатического запора, вероятно, за счет стимуляции секреции хлоридов и воды в просвет толстой кишки.Успех этого лечения согласуется с ролью ClC-2 также в апикальной секреции хлоридов (Cuppoletti et al., 2004). Во время разработки ClC-2 сильно экспрессируется в легочной ткани и был предложен в качестве потенциального пути для замены отсутствующей проводимости хлоридов у пациентов, страдающих муковисцидозом (Schwiebert et al., 1998, -2). Однако мыши Clcn 2 -/- не страдают легочными заболеваниями, а дополнительный нокаут ClC-2 у мышей CFTR -/- не ухудшил фенотип муковисцидоза у этих животных (Zdebik et al. др., 2004). Исследования мышей с нокаутом также выявили дегенерацию яичек и дегенерацию сетчатки, что подчеркивает роль ClC-2 в пигментном эпителии сетчатки и в клетках Сертоли, где этот канал может участвовать в регуляции высокоспециализированной секреции жидкости этими тканями (Bösl et al. ., 2001). Хотя это и не связано с каким-либо почечным заболеванием, экспрессия ClC-2 также была обнаружена в почках (Thiemann et al., 1992). Анализ транскриптов мРНК выявил значительную экспрессию во всех сегментах нефрона, за исключением кортикального собирательного протока и наружного мозгового вещества собирательного протока, и было обнаружено, что он модулируется альдостероном у крыс (Ornellas et al., 2002). Было также показано, что ClC-2 экспрессируется в скелетных мышцах (Thiemann et al., 1992). Однако токи ClC-2 не могли быть зарегистрированы ни в почках, ни в скелетных мышцах. Вполне возможно, что ClC-2 может образовывать гетеродимеры в этих тканях, где экспрессируются другие каналы CLC, такие как ClC-1 (Lorenz et al., 1996; Stölting et al., 2014) или каналы ClC-K.

ClC-2 экспрессируется в эпителии, а также в возбудимых клетках. (A) В энтероцитах толстой кишки хлорид абсорбируется со стороны просвета через хлоридно-бикарбонатный обменник, а затем транспортируется через базолатеральный ClC-2 в интерстиций.Натрий следует через просветный канал или натрий/протонный обменник и транспортируется в интерстиций с помощью Na + /K + АТФазы (Catalán et al., 2002). (B) Роль ClC-2 в возбудимых клетках, таких как нейроны, все еще обсуждается. Вероятный механизм оставляет ClC-2 закрытым при эквивалентном калиевом мембранном потенциале покоя, но изменения потенциала реверсии хлоридов за счет притока Cl открывают ClC-2 и обеспечивают отток хлоридов через этот канал.Отток хлоридов, возможно, вызывает деполяризацию мембран и повышенную возбудимость. (C) Одноканальные записи мутантных каналов ClC-2 с мутациями, обнаруженными у пациентов с идиопатической эпилепсией. Эти мутации сокращают длительные закрытые состояния, вызванные закрытием общих ворот. (D) График вероятности нахождения канала ClC-2 в закрытом состоянии в течение указанного времени демонстрирует ассоциированные с заболеванием изменения общего. (E) W570X, недавно обнаруженный у пациентов с идиопатической генерализованной эпилепсией, вызывает такое же ускорение активации и деактивации ClC-2, как и ранее изученный мутант H573X, при экспрессии в клетках HEK293. (F) H573X частично открывает медленные ворота ClC-2. (C,D) были воспроизведены и изменены из Stölting et al. (2013). Данные H573X ClC-2 были воспроизведены и изменены из Garcia-Olivares et al. (2008).

ClC-2 экспрессируется в нейрональных и глиальных клетках (Staley, 1994; Nobile et al., 2000; Sìk et al., 2000), но его роль в центральной нервной системе еще недостаточно изучена. Мутации в гене CLCN2 были обнаружены у пациентов с идиопатической генерализованной эпилепсией, а также при лейкоэнцефалопатии (D’Agostino et al., 2004; Клефус-Ли и др., 2009 г.; Сен-Мартен и др., 2009 г.; Классен и др., 2011; Депьен и др., 2013; Штёльтинг и др., 2013). Мутации потери функции CLCN2 приводят к вакуолизации миелина в головном и спинном мозге и к легким неврологическим нарушениям, таким как мозжечковая атаксия (Depienne et al., 2013). Отсутствие ClC-2 вызывает аналогичные патологические изменения у пациентов-людей, наблюдаемые у мышей Clcn 2 -/- . Сходные изменения в морфологии мозга вызываются потерей GlialCam и MLC1, скорее всего, потому, что эти белки собираются в белковый комплекс, препятствующий образованию таких вакуолей.

Clcn 2 -/- мыши демонстрируют аномальную корковую активность и более высокую восприимчивость к индуцированным припадкам, но не проявляют явных признаков эпилептических припадков у животных (Blanz et al., 2007; Cortez et al., 2010). Изменения в динамической регуляции внутринейрональной концентрации хлоридов могут лежать в основе этой повышенной возбудимости (Blanz et al., 2007; Földy et al., 2010). Активация рецепторов GABA A гиперполяризует нейроны за счет временного притока хлоридов.ClC-2 может активироваться в результате увеличения внутриклеточного [Cl ] и обеспечивать путь выхода ионов хлорида (рис. 1). Этот механизм был впервые продемонстрирован в экспериментах, в которых ClC-2 экспрессировался в ганглиозных клетках задних корешков. Этот маневр уменьшил [Cl ] int и инвертировал деполяризующие токи в гиперполяризующие ГАМК (Staley et al., 1996). Другой возможный механизм постулирует, что каналы ClC-2 могут оставаться открытыми при положительном напряжении и обеспечивать реполяризующий приток хлорида (Ratté and Prescott, 2011).

Несколько миссенс-мутаций CLCN2 , обнаруженных у пациентов, страдающих идиопатической эпилепсией, изменяют гейтирование ClC-2 сходным образом (рисунки ), т. е. более быстрое время активации и деактивации. Это однородное функциональное последствие поддерживает представление о том, что эти изменения в закрытии каналов могут способствовать патогенезу эпилепсии. У мутанта ClC-2 отток хлорида после повторной стимуляции ГАМК будет активироваться быстрее и, таким образом, проводить деполяризующий ток с более быстрым началом, чем каналы дикого типа.Причинная роль мутаций CLCN2 в прошлом подвергалась сомнению несколькими авторами (Niemeyer et al., 2010; Depienne et al., 2013; Jentsch, 2013). Одним из аргументов было то, что эти мутации не связаны с эпилепсией в менделевском стиле. Некоторые из этих вариаций последовательности обнаруживают неполную косегрегацию и встречаются не только у пораженных, но и у здоровых особей одной и той же семьи. Однако такой тип наследования не является редкостью при идиопатической генерализованной эпилепсии. Появляется все больше доказательств того, что это заболевание возникает не просто из-за возникновения отдельных болезнетворных мутаций, а скорее является результатом сосуществования множественных вариаций последовательностей, влияющих на разные гены (Klassen et al., 2011). Проявление и тяжесть заболевания зависят от комбинированных функциональных последствий множественных совпадающих генетических факторов риска, способствующих повышенной возбудимости центральной нервной системы. Модель полигенной гетерогенности предполагает, что мутации CLCN2 и влияют на возбудимость нейронов, но эти изменения приводят только к эпилепсии вместе с мутациями в других генах (Klassen et al., 2011).

Одна из мутаций, связанных с идиопатической эпилепсией, W570X, также была идентифицирована в исследовании секвенирования генома пациентов с лейкоэнцефалопатией (Depienne et al., 2013). Эта мутация очень похожа на укорочение ClC-2, изученное ранее в нашей лаборатории, и вызывает сильное ускорение активации и инактивации ворот с почти постоянно открытыми медленными воротами (Рисунки) (Garcia-Olivares et al., 2008). Однако у пациента, страдающего лейкоэнцефалопатией, не было судорог, предположительно из-за почти полной деградации усеченного мутантного канала (Depienne et al., 2013).

CLC-Ka/CLC-Kb

ClC-Ka и ClC-Kb экспрессируются исключительно в нефроне и сосудистой полоске внутреннего уха (рис. ).Физиологическая роль этих белков была выяснена после появления мыши Clcnk 1 -/- (ClC-K1 является гомологом ClC-Ka для грызунов) с выраженным несахарным диабетом и сцеплением CLCNKB с Синдром Барттера, состояние человека, характеризующееся нарушением концентрации почечной мочи, что приводит к гипотензии с повышенными уровнями ренина и альдостерона (Simon et al., 1997; Matsuura et al., 1999). Эти данные свидетельствуют о том, что ClC-Ka и ClC-Kb имеют решающее значение для нормальной концентрации мочи.

ClC-K каналы необходимы для трансэпителиального транспорта растворенных веществ в петле Генле и сосудистой полоске внутреннего уха. (A) Экспрессия ClC-Ka/barttin и ClC-Kb/barttin в тонкой восходящей и толстой восходящей части петли Генле. Хлорид абсорбируется на просветной стороне либо за счет вторично-активного транспортного механизма, либо путем диффузии через апикальные каналы, а затем проводится через ClC-Ka/барттин или ClC-Kb/барттин к интерстициальной стороне. ClC-Ka/barttin необходим для пассивной реабсорбции NaCl в тонких восходящих ветвях.В толстой восходящей части ClC-Kb/barttin поддерживает базолатеральный отток хлоридов, необходимый для электрогенной абсорбции NaCl. Поглощение NaCl устанавливает трансэпителиальный потенциал, который дополнительно управляет парацеллюлярным потоком Mg 2+ или Ca 2+ . (B) ClC-Ka/barttin и ClC-Kb/barttin опосредуют базолатеральный отток хлоридов и поддерживают зарядку эндолимфы посредством секреции K + в сосудистой полоске. (C) Считается, что Барттин связывается со спиралью B (пурпурный) и J (синий) каналов ClC-K (Tajima et al., 2007). (D) Конфокальные флуоресцентные изображения (любезно предоставленные доктором Даниэлем Войцеховски) только YFP-ClC-Ka показывают преимущественное окрашивание внутриклеточных мембран (слева). При совместной экспрессии CFP-barttin ClC-Ka перемещается на плазматическую мембрану (правая сторона). (E) Барттин переключает ClC-Ka и ClC-Kb в активное состояние, как видно на нормализованном графике зависимости тока от напряжения. (F) Барттин увеличивает комплексное гликозилирование (#) и стабильность комплекса ClC-K/барттин в плазматической мембране. (A,B) изменены после Fahlke and Fischer (2010).

Первоначальные попытки охарактеризовать функцию этих каналов не увенчались успехом (Kieferle et al., 1994), поскольку ClC-Ka и Kb могут функционально экспрессироваться только вместе с дополнительной субъединицей бартина (Estévez et al., 2001; Waldegger et al., 2002; Шолль и др., 2006). Барттин был клонирован как продукт гена болезни синдрома Барттера 4 типа, сочетающего выраженные почечные симптомы других синдромов Барттера с нейросенсорной глухотой (Birkenhäger et al., 2001). Это белок из 320 аминокислот, который содержит два предполагаемых трансмембранных домена, за которыми следует длинный карбокси-конец. Укорочения barttin после положения 72 практически не затрагивают функцию ClC-K/barttin каналов в гетерологичных системах экспрессии (Scholl et al., 2006; Janssen et al., 2009). Предполагается, что взаимодействие Барттина с каналами ClC-K происходит вдоль двух трансмембранных спиралей B и J, но дополнительные подробности о взаимодействии канала и вспомогательной субъединицы все еще отсутствуют (рис. ) (Tajima et al., 2007).

У мышей и крыс ClC-K1, ClC-K2 и барттин распределяются, начиная с тонкого и заканчивая толстым восходящим протоком петли Генле и заканчивая собирательным протоком (Vandewalle et al., 1997; Waldegger et al. , 2002; Ниссан и др., 2004). Две изоформы ClC-K, однако, демонстрируют различия в их экспрессии в разных частях нефрона, так что в настоящее время считается, что каналы, состоящие из ClC-Ka и бартина, опосредуют прохождение Cl через эпителий преимущественно в тонком восходящем эпителии. конечности, в то время как ClC-Kb/barttin, как полагают, необходим для обратного захвата хлоридов в толстой восходящей конечности и поддержания трансэпителиального потенциала, который приводит к парацеллюлярной абсорбции различных катионов, включая Ca 2+ и Mg 2+ .ClC-K и barttin также проявляют обильную экспрессию в сосудистой полоске внутреннего уха. Каналы ClC-K/barttin обеспечивают базолатеральный отток ионов Cl , накопленных котранспортером NKCC1 Na + -K + -Cl , что необходимо для генерации эндокохлеарного потенциала.

Ни экспрессия ClC-Ka, ни ClC-Kb не приводят к видимым токам при отсутствии субъединицы бартина. Барттин выполняет несколько функций на каналах ClC-K.Он поддерживает выход из эндоплазматического ретикулума, стимулирует вставку и нарушает удаление ClC-Ks из поверхностной мембраны (рис. 1) (Scholl et al., 2006). Более того, барттин повышает стабильность белка ClC-K за счет стимуляции комплексного гликозилирования (Рисунки) (Hayama et al., 2003; Scholl et al., 2006; Janssen et al., 2009). ClC-Ka и ClC-Kb не функционируют без вспомогательной субъединицы и переключаются в проводящее состояние за счет ассоциации с бартином. При совместной экспрессии ClC-Ka и ClC-Kb проявляют независимые от времени, в основном не выпрямляющие токи (Janssen et al., 2009; Фишер и др., 2010). Каналы ClC-Ka/барттина постоянно открыты при положительном напряжении до -150 мВ. Спад вероятности размыкания при отрицательном напряжении до -150 мВ приводит к характерному «крючку» на макроскопических графиках вольт-амперной характеристики. Одноканальная проводимость ClC-Ka составляет примерно 30 пСм и, таким образом, значительно больше, чем у других каналов CLC (рис. 1). До сих пор не определены унитарные свойства ClC-Kb.

Несколько миссенс-мутаций CLCNKB были обнаружены у пациентов с синдромом Барттера (Simon et al., 1997; Фукуяма и др., 2004). Эти мутации обычно вызывают потерю функции канала и, таким образом, ожидается, что они уменьшат реабсорбцию воды, влияя на кортико-медуллярный осмотический градиент. Имеется одно сообщение о пациенте с комбинированными мутациями в CLCNKA и CLCNKB . Как и ожидалось, пациент страдает тяжелой формой почечной недостаточности и нейросенсорной глухотой, которые очень похожи на мутации в гене BSND , которые также влияют на оба хлоридных канала одновременно (Schlingmann et al., 2004). Одна мутация, предсказывающая T481S ClC-Kb, была обнаружена при генетическом скрининге когорт гипертоников. В гетерологичных системах экспрессии это позволяет открывать каналы ClC-Kb даже в отсутствие бартина (Jeck et al., 2004; Sile et al., 2009). Мутация может увеличить реабсорбцию соли и, следовательно, воды и, таким образом, повысить системное кровяное давление. Более того, увеличение токов хлора в сосудистых полосках увеличивает эндокохлеарный потенциал и тем самым снижает порог слышимости (Frey et al., 2006). Поскольку уменьшение объема крови за счет увеличения экскреции воды может усилить секрецию ренина и активировать ренин-ангиотензин-альдостероновую систему (РААС), потеря функции ClC-K/бартиновых каналов может увеличить риск сердечной недостаточности. Недавно сообщалось, что вариант CLCNKA , предсказывающий R83G ClC-Ka, приводит к потере функции этого канала и был предложен как фактор риска сердечной недостаточности (Cappola et al., 2011). Другие встречающиеся в природе варианты ClC-Ka, которые повышают системное кровяное давление после увеличения нагрузки NaCl, были связаны с хронической солевой гипертензией (Barlassina et al., 2007).

Важная роль ClC-K/бартиновых каналов в регуляции содержания соли и воды в организме делает эти каналы важной мишенью для фармакологического вмешательства (Picollo et al., 2004; Liantonio et al., 2006, 2012; Imbrici et al. др., 2014). Активаторы ClC-K/barttin могут корректировать потерю функции каналов, несущих естественные мутации, связанные с синдромом Барттера или идиопатической глухотой. Блокаторы ClC-K/каналов бартина могут служить диуретиками или антигипертензивными препаратами.Однако существуют потенциальные побочные эффекты, которые следует тщательно изучить. Слух оказывается гораздо более чувствительным к активности ClC-K каналов (Riazuddin et al., 2009), чем функция почек. Хотя гемато-лабиринтный барьер защищает эпителий внутреннего уха от общего кровообращения (Juhn and Rybak, 1981), некоторые соединения, такие как салицилат, фуросемид или аминогликозидные антибиотики, легко влияют на функцию внутреннего уха. Кроме того, длительное наблюдение за пациентами, страдающими синдромом Барттера, выявило стойкую гиперренинемию, вторичный гиперальдостеронизм и развитие протеинурии у многих пациентов, даже если другие симптомы достаточно хорошо контролировались (Bettinelli et al., 2007). Поэтому возможные побочные эффекты фармакологических изменений в функции ClC-K должны быть тщательно проверены и могут даже препятствовать широкому клиническому использованию.

Миссенс-мутации, препятствующие экспрессии barttin, приводят к очень тяжелому почечному фенотипу (Janssen et al., 2009; Fahlke and Fischer, 2010; Nomura et al., 2011), часто с терминальной стадией почечной недостаточности в молодом возрасте. Поскольку др. мутации BSND , которые также отменяют образование функционального ClC-K/barttin, действительно сохраняют почечную функцию, возникает соблазн предположить, выполняют ли эти каналы дополнительные функции в почечных клетках.Успешное лечение этих редких случаев может потребовать лучшего понимания взаимодействия ClC-K с субъединицей barttin. Однако в настоящее время неясно, как барттин взаимодействует с каналами ClC-K, а также неясно, может ли это взаимодействие быть нацелено на изменение функции канала.

Outlook

Анионные каналы существуют во всех клетках человеческого тела и выполняют множество физиологических функций. Важность этих каналов подчеркивается генетическими вариантами, связанными с основными заболеваниями.Эволюция привела к множеству семейств анионтранспортных белков с очень разными функциями и физиологическими ролями. Семейство CLC в настоящее время является крупнейшим известным семейством генов, кодирующих анионные каналы и транспортеры, и многие аспекты функции CLC-каналов уже хорошо изучены. Функцию канала CLC изучали с помощью записи патч-клэмпа целых клеток и одного канала и флуоресцентной визуализации. Трехмерные структуры родственных белков позволили получить детальное представление о молекулярной архитектуре этих белков.Используя модели животных с нокаутом и нокаутом, мы можем изучать влияние функций CLC на клеточные процессы.

CLC-каналы функционально сильно отличаются от потенциалзависимых катионных каналов, и многие из этих особых свойств обусловлены их эволюцией от транспортеров. Многие вторично-активные транспортеры могут принимать режимы проскальзывания, подобные каналам (DeFelice and Goswami, 2007). Однако в семействе CLC претерпело довольно строгое разделение этих мод на антипортеры и каналы без транспортной активности.Молекулярные детерминанты этой дифференциации не ясны. В то время как замена одной аминокислоты (D136G) может преобразовать один канал, ClC-1, в канал со свойствами, очень похожими на ClC-2, еще не удалось преобразовать канал CLC в переносчик CLC. Каналы CLC привлекли большое внимание благодаря своей уникальной двуствольной конструкции. Мы до сих пор не понимаем молекулярных функций и физиологического воздействия этой любопытной конструкции. Как эти две субъединицы взаимодействуют друг с другом и каково физиологическое преимущество наличия двух более или менее синхронизированных пор?

Недавно предсказанная локализация ClC-1 в центральной нервной системе поднимает вопросы относительно потенциальной роли этого канала в этой системе органов.До сих пор неясно, как ClC-2 предотвращает нейродегенерацию и какую роль мутантный ClC-2 играет в повышенной возбудимости центральной нервной системы. ClC-Ka и -Kb являются важными фармакологическими мишенями, однако ни одно соединение, нацеленное на эти каналы, еще не вошло в клиническую практику. Возможное образование гетеродимерных каналов CLC со свойствами, сильно отличающимися от свойств гомодимерных каналов, также требует дальнейшего изучения. Хотя существует много знаний о хлоридной проводимости каналов CLC, возможно, стоит также изучить проникновение бикарбоната.Нам также не хватает полного молекулярного понимания того, как вспомогательные субъединицы, такие как barttin или GlialCAM, модифицируют CLC-каналы.

Изучение семейства CLC всегда было обусловлено как интересом к биофизическим свойствам, так и их физиологической значимостью. Последние 25 лет предоставили знания и инструменты для решения многих остающихся вопросов. Мы надеемся, что эта работа приведет к детальному пониманию молекулярной физиологии и патофизиологии этих каналов и может улучшить качество жизни многих пациентов с редкими или распространенными заболеваниями.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

ClC-5, хлоридный канал, мутировавший при болезни Дента, колокализуется с протонным насосом в эндоцитотически активных клетках почек

Клеточная и субклеточная локализация канала ClC-5 Cl

.

Каждая клетка млекопитающих экспрессирует H + -АТФазу V-типа, которая необходима для подкисления нескольких внутриклеточных органелл.В почках два типа клеток, клетки проксимальных канальцев и ICs собирательных трубочек, сильно экспрессируют протонную помпу (17). Именно эти клетки также сверхэкспрессируют канал ClC-5 Cl . В проксимальных канальцах и в α-ICs ClC-5 и Н + -АТФаза совместно локализуются в одних и тех же субклеточных областях. Экспрессия обоих белков также перекрывается в β-ICs, но протонная помпа локализуется преимущественно в базолатеральной области, тогда как ClC-5 диффузно локализуется в апикальной цитоплазме.

Клетки проксимальных канальцев и ICs участвуют в кислотно-щелочном транспорте и в эндоцитозе. Проксимальные канальцы и α-IC секретируют кислотные эквиваленты в просвет канальцев, тогда как β-ICs реабсорбируют кислоту. В то время как секреция кислоты клетками проксимальных канальцев лишь частично обусловлена ​​H + -АТФазой (это происходит в основном с помощью апикального Na + /H + -обмена), она происходит главным образом с помощью H + -АТФаза в ИС. В этих клетках секреция и реабсорбция кислоты регулируются введением и извлечением протонных насосов в апикальную и базолатеральную мембраны соответственно (17, 30, 31).Эти процессы происходят путем эндо- и экзоцитоза. Большая часть протонной помпы обычно находится во внутриклеточных везикулах. Диффузное внутриклеточное окрашивание IC с антителом ClC-5, колокализация с протонной помпой на световом микроскопическом уровне и наша иммуноэлектронная микроскопия убедительно свидетельствуют о том, что ClC-5 присутствует в везикулах, содержащих протонную помпу. ICs также активно поглощают маркеры жидкой фазы, такие как флуоресцеин-декстран (30, 32), но неизвестно, является ли эта эндоцитотическая активность только побочным продуктом инсерционной регуляции протонной помпы.

Напротив, выраженная эндоцитотическая активность клеток проксимальных канальцев служит четко определенной роли, т. е. почти количественной реабсорбции белков, достаточно малых для прохождения клубочкового фильтра (9-11). Эта высокая эндоцитотическая активность коррелирует с областью под щеточной каймой клеток проксимальных канальцев, которая заполнена эндоцитозными везикулами, эндосомами и рециклирующими везикулами. Максимум экспрессии ClC-5 происходит именно в этой области. В той же области мы также обнаружили эндоцитированный β 2 -микроглобулин, колокализация которого с ClC-5 была наиболее значительной через короткие промежутки времени после поглощения.Т.о., если ClC-5 играет роль в эндоцитозном пути, он может быть важен скорее для ранних, чем для поздних стадий. Этот вывод также подтверждается колокализацией с rab5, маркером ранних эндосом, в трансфицированных клетках (Fig. 4).

ClC-5 был преимущественно обнаружен в везикулярных компартментах внутри клетки, но он также может экспрессироваться на плазматической мембране. Это выражение было наиболее очевидным в трансфицированных клетках. Иммуноцитохимия α-IC также предполагает локализацию ClC-5 на апикальной мембране.Однако разрешения конфокальной лазерной микроскопии недостаточно, чтобы определить, находится ли ClC-5 в плазматической мембране клеток почечных канальцев или он присутствует исключительно в везикулах непосредственно под апикальной мембраной. Хотя ясно, что ClC-5 находится в основном во внутриклеточных везикулах, экспрессия клеточной поверхности кажется необходимой для объяснения токов Cl , наблюдаемых в экспрессирующих ClC-5 ооцитах (2, 4, 6, 7) и трансфицированных клетках (неопубликованные результаты). ).

Возможные роли ClC-5 в кислотном транспорте и эндоцитозе.

Присутствие ClC-5 в везикулах эндоцитозного пути и, в меньшей степени, на клеточной поверхности предполагает две гипотезы относительно функции ClC-5: во-первых, ClC-5 может играть роль на клеточной поверхности, а его присутствие в эндоцитозных везикулах служит только для регуляции его локализации в плазматической мембране путем эндо- и экзоцитоза, аналогично регуляции протонной помпы в ICs. Во-вторых, ClC-5 может функционировать главным образом в везикулах эндоцитотического пути, а экспрессия на клеточной поверхности является просто побочным продуктом рециркуляции везикул через плазматическую мембрану.

Эти гипотезы не исключают друг друга. Колокализация с протонным насосом предполагает, что ClC-5 служит проводящим путем для электронейтрального транспорта кислоты. Это может происходить как внутри везикул, так и на плазматической мембране. Действительно, каналы Cl наблюдались в ICs, хотя апикальные каналы Cl в основном были обнаружены в β-ICs (25). Однако их свойства, по-видимому, отличаются от свойств ClC-5, экспрессированных в ооцитах Xenopus (4).Хотя уровень внутриклеточного Cl обычно намного выше электрохимического равновесия через апикальную мембрану, также есть некоторые предположения, что каналы Cl встраиваются вместе с H + -АТФазой в апикальную мембрану клеток проксимальных канальцев. 30, 33).

Для объяснения протеинурии при болезни Дента роль ClC-5 в подкислении везикул в эндоцитотическом пути гораздо более привлекательна (3, 4, 34). Многие внутриклеточные органеллы подкисляются Н + -АТФазами (13, 17).Вдоль эндоцитотического пути внутривезикулярный рН становится все более кислым на пути от эндоцитозных везикул к ранним и поздним эндосомам и, наконец, к лизосомам, внутренний рН которых составляет примерно от 5,0 до 5,5.

Подкисление в эндоцитозном пути необходимо для взаимодействия рецептор-лиганд и нескольких событий сортировки (35–37). Ингибирование закисления эндосом либо путем ингибирования Н + -АТФазы, либо путем рассеивания градиента рН серьезно нарушает функцию эндоцитотического пути.Это приводит, например, к замедлению эндоцитотической рециркуляции и внутриклеточному удержанию рецепторов рециркуляции (36, 38), к нарушению извлечения белков транс-Гольджи с клеточной поверхности (39) и к дефектному внутриклеточному транспорту эндоцитированных маркеров (39). 14, 15). Это вмешательство может происходить на разных стадиях эндоцитотического пути, возможно, в зависимости от типа клеток (14, 15, 40, 41). Подщелачивание эндосом снижает эндоцитоз альбумина в клетках OK, в клеточной линии проксимальных канальцев почек (16), а мутанты клеток СНО, нарушенные в эндоцитозе, имеют дефекты эндосомального закисления (42, 43).Таким образом, имеются убедительные доказательства того, что эндосомальное закисление необходимо для общего процесса эндоцитоза.

H + -АТФаза V-типа является электрогенной: перекачивая H + , она переносит как кислотные эквиваленты, так и электрический заряд (17). Кислотные эквиваленты буферизуются более эффективно, чем электрический заряд, который «буферизируется» емкостью мембраны везикулы. Как следствие, внутреннее положительное напряжение на мембранах везикул будет энергетически ограничивать градиент рН, достигаемый за счет гидролиза АТФ.Эффективная накачка требует параллельной проводимости, что приводит к общему электронейтральному транспорту. В некоторых препаратах везикул подкисление зависит от присутствия цитоплазматических анионов, что предполагает наличие проводимости Cl (18-20). Подкисление эндосом из проксимальных канальцев почек стимулируется анионами, причем хлорид более эффективен, чем йодид (18). Это наблюдение хорошо согласуется с селективностью Cl > I канала ClC-5 Cl (4).

Молекулярная идентичность каналов Cl , участвующих в эндосомальном закислении, остается неясной. Наша работа предполагает, что канал ClC-5 Cl может быть таким ограничивающим скорость каналом Cl в эндосомах проксимальных канальцев почек. Это предположение основано на присутствии ClC-5 в эндосомах, его колокализации с эндоцитированным белком и Н + -АТФазой в проксимальных канальцах, известной необходимости эндосомального закисления для эндоцитоза и, наконец, протеинурии, наблюдаемой при синдроме Дента. болезнь.Избирательное увеличение содержания низкомолекулярных белков в моче указывает на специфический дефект реабсорбции белков проксимальными почечными канальцами, преобладающим местом экспрессии ClC-5. Пациенты с болезнью Дента представляют «нокаутную» модель канала ClC-5 Cl . Действительно, все мутации болезни Дента, проанализированные в системе экспрессии ооцитов Xenopus , либо отменили, либо в значительной степени уменьшили токи Cl (2, 6, 7).

Хотя это наблюдение предполагает, что ClC-5 может ограничивать скорость эндоцитоза в проксимальных канальцах, он не может играть универсальную роль в эндоцитозе.Если бы это было так, мутации в ClC-5 были бы летальными. Поскольку ClC-5 экспрессируется высокоспецифичным образом, разные каналы Cl могут играть аналогичные роли в других клетках и органеллах. Другие каналы Cl , такие как CFTR, также были предложены как важные для переноса через мембраны (44), но это спорно (45). Мы предполагаем, что другие каналы CLC Cl окажутся играющими аналогичные роли.

Косвенное подтверждение роли CLC-каналов в подкислении внутриклеточных компартментов исходит также от дрожжей: разрушение CLC дрожжей ( GEF1 ) (46), которые находятся во внутриклеточных везикулах (47), которые, как недавно было показано, представляют собой компартмент Гольджи (48 , 49), или GEF2 ( VMA3 ), субъединицы вакуолярной Н + -АТФазы, вызывает идентичные фенотипы (46).Это включает чувствительность к более щелочным значениям pH (48, 49), что соответствует роли CLC дрожжей в подкислении. У млекопитающих ClC-3 и ClC-4 могут иметь функции, сходные с ClC-5, хотя предполагалось, что ClC-3 является активируемым набуханием каналом (50). Эти белки примерно на 80% идентичны ClC-5 и более широко экспрессируются (5). Частично перекрывающиеся паттерны экспрессии могут объяснить, почему при болезни Дента отсутствует дефект закисления мочи, несмотря на заметную экспрессию ClC-5 в ICs. Гибридизация in situ показала, что ClC-3 также экспрессируется в β-IC (51).Удивительно, но это исследование обнаружило мРНК ClC-5 только в α-, но не в β-, ICs, и не удалось обнаружить сообщение ClC-5 в проксимальных канальцах.

Механизм, посредством которого разрушение ClC-5 приводит к образованию камней в почках, неизвестен и может быть сложным. Например, гиперкальциурия может быть вторичной по отношению к потере регуляторных белков, обычно реабсорбирующихся в почках, или дефект транспорта может изменить локализацию других каналов или транспортеров.

Таким образом, ClC-5 экспрессируется в основном во внутриклеточных везикулах как в эндоцитотически активных клетках почек, так и в трансфицированных клетках.Наши данные свидетельствуют о том, что ClC-5 может ограничивать скорость закисления эндоцитозных компартментов в проксимальных канальцах, что приводит к протеинурии, наблюдаемой при болезни Дента. Мы предполагаем, что разнообразие эндоцитозных процессов или, в более общем смысле, внутриклеточного переноса везикул может отражаться в молекулярном разнообразии не только субъединиц H + -ATPase (17), но также и внутриклеточных каналов Cl .

CLCNKA — обзор | ScienceDirect Topics

Х-сцепленный рецессивный ННД

ННД характеризуется теми же симптомами несахарного диабета, что и FNDI, но демонстрирует нечувствительность почек к антидиуретическому эффекту эндогенно продуцируемого АВП, а также к лечению dDAVP (таблица 5.2). Как упоминалось ранее, он наследуется либо по Х-сцепленному рецессивному типу (примерно в 90% случаев НДИ) (OMIM: 304800) и вызывается мутациями в гене AVPR2 , либо по аутосомно-доминантному или рецессивному типу (примерно в 10% случаев NDI) (OMIM: 125800) и вызваны мутациями в гене AQP2 (таблица 5.2). Кроме того, наследственный НДИ встречается в сложных формах, характеризующихся потерей воды и ионов, например синдром Барттера (OMIM: 601678, 241200, 607364 и 602522).Эти редкие варианты форм NDI вызваны мутацией в генах ( KCNJ1 , SLC12A1 , CLCNKB , CLCNKB и CLCNKA в комбинации или BSND ). нарушение внутримозгового механизма концентрации и, как следствие, полиурия и полидипсия вместе с характерными нарушениями электролитного баланса. 45 Однако нарушения электролитного баланса четко отличают эти состояния от истинного несахарного диабета.

Клинические характеристики NDI, связанные с мутациями в гене AVPR2 или AQP2 , независимо от типа наследования или конкретной вовлеченной мутации, включают гипернатриемию, гипертермию, умственную отсталость и повторяющиеся эпизоды обезвоживания, если пациенты не могут получить достаточно вода. В отличие от аутосомно-доминантного FNDI, дефект концентрации мочи присутствует при рождении, и новорожденные и дети грудного возраста особенно склонны к обезвоживанию (таблица 5.2).Кроме того, клиническая картина обезвоживания в этом возрасте часто трудно интерпретируется (обычно проявляется задержкой развития), в связи с чем наблюдаются тяжелые случаи длительного обезвоживания. Умственная отсталость преобладала у 70–90% пациентов, о которых сообщалось в первоначальных исследованиях NDI, и считалась частью заболевания. 46 Однако раннее распознавание NDI на основе генетического скрининга детей из группы риска и раннего лечения заболевания позволяет таким детям иметь нормальное физическое и умственное развитие 47 и позволяет предположить, что умственная отсталость, о которой сообщалось в исходных исследованиях, вероятно, возникла от повторяющихся эпизодов сильного обезвоживания, а не от патологий, непосредственно вызванных генетическим дефектом.

Сцепленная с Х-хромосомой рецессивная и наиболее частая форма семейного NDI вызывается мутациями потери функции в гене AVPR2 , кодирующем почечный рецептор вазопрессина V2. В настоящее время в более чем 300 семьях идентифицировано не менее 214 предполагаемых болезнетворных мутаций в гене AVPR2 . 7,10,48 Обычно гетерозиготные женщины не имеют симптомов, но в некоторых случаях могут иметь разную степень полиурии и полидипсии из-за асимметричной инактивации Х-хромосомы. 47 Недавние сообщения о пациентах с мутациями в гене AVPR2 , у которых первоначально подозревали FNDI из-за в некоторых случаях впечатляющего антидиуретического ответа на экзогенный AVP 49 , подчеркивали важность генетического тестирования и усложняли диагностику. Клинический дифференциальный диагноз при несахарном диабете.

Молекулярный механизм, лежащий в основе нечувствительности почечного AVP при NDI, различается в зависимости от аллелей заболевания. Следовательно, мутаций AVPR2 были разделены на пять разных классов в соответствии с их патогенным действием на клеточном уровне, 50 точно так же, как система, используемая для классификации мутантных рецепторов липопротеинов низкой плотности (LDL).Большинство мутаций в гене AVPR2 (> 50%) приводят к тому, что рецепторы вазопрессина V2 захватываются внутри клетки из-за нарушения внутриклеточного транспорта, и, следовательно, они не могут достичь плазматической мембраны и связать лиганд (AVP) (тип 2). мутации). Другие мутации приводят к нестабильности мРНК, и, следовательно, к белковому продукту (мутации типа 3) или мутантным рецепторам вазопрессина V2, которые достигают клеточной поверхности, но либо не могут эффективно связывать AVP (лиганд) (мутации типа 1), либо должным образом вызывать увеличение продукция внутриклеточного циклического АМФ (цАМФ) (мутации 4-го типа).

Лечение пациентов с NDI с помощью dDAVP обычно неэффективно, хотя у женщин с симптомами, обусловленными асимметричной инактивацией Х-хромосомы, и у пациентов с частичным NDI можно облегчить течение несахарного диабета с помощью высоких доз, возможно, потому, что у таких пациентов сохраняется некоторое количество функционального вазопрессина Рецепторы V2. Диета с низким содержанием натрия для снижения нагрузки растворенных веществ на почки и лечение тиазидными диуретиками в сочетании с ингибитором циклооксигеназы (индометацином) или гидрохлоротиазидом в сочетании с амилоридом представляют собой схемы лечения, которые в некоторой степени могут облегчить симптомы ННД. 8 Новые стратегии, предлагаемые для лечения NDI: антагонисты и агонисты рецепторов вазопрессина V2, фармакологические шапероны, непептидные агонисты, активация пути циклического гуанозинмонофосфата, активация пути цАМФ, статины, простагландины и молекулярные шапероны. Для подробного обсуждения этих подходов мы отсылаем к работе. [8].

Хлоридные каналы и эндоцитоз: новый взгляд на болезнь Дента и у мышей с нокаутом ClC-5 — полный текст — Nephron Physiology 2005, Vol.99, № 3

Аннотация

Болезнь Дента — наследственное заболевание почечных канальцев, характеризующееся низкомолекулярной (НМ) протеинурией, гиперкальциурией и нефролитиазом. Заболевание связано с мутациями ClC-5, члена семейства потенциалзависимых хлоридных каналов CLC. ClC-5 частично экспрессируется в клетках, выстилающих проксимальные канальцы (ПТ) почки, где он колокализуется с альбуминсодержащими эндоцитарными везикулами, относящимися к рецептор-опосредованному эндоцитарному пути, который обеспечивает эффективную реабсорбцию ультрафильтрованных белков LMW.Поскольку прогрессия вдоль эндоцитарного аппарата требует подкисления эндосом, было высказано предположение, что дисфункция ClC-5 в эндосомах может приводить к неэффективной реабсорбции белков LMW и дисфункции PT-клеток. Анализ мышиной модели с нокаутом ClC-5 (KO), демонстрирующей все характерные дефекты почечных канальцев при болезни Дента, показал наличие тяжелой протеинурии LMW. Цитохимические исследования с эндоцитарным индикатором, пероксидазой, показали плохой перенос в ранние эндоцитарные везикулы, предполагая, что нарушение рецептор-опосредованного эндоцитоза в PT-клетках является основой для дефектного поглощения белков LMW у пациентов с болезнью Дента.Эндоцитоз и процессинг белков LMW включают мультилигандные тандемные рецепторы, мегалин и кубилин, которые обильно экспрессируются на щеточной кайме PT-клеток. Характеристика эндоцитарного дефекта у мышей ClC-5 KO показала, что были затронуты лиганды как мегалина, так и кубилина. Общее почечное содержание мегалина и особенно кубилина на уровне белка было снижено, но, что более важно, с помощью аналитического субклеточного фракционирования и количественного мечения иммунозолотом мы продемонстрировали селективное исчезновение мегалина и кубилина на щеточной кайме PT-клеток.Эти наблюдения позволили нам заключить, что дефектный белковый эндоцитоз, связанный с инактивацией ClC-5, обусловлен, по крайней мере частично, значительной и селективной потерей мегалина и кубилина на щеточной кайме, отражая дефект транспорта в почечных PT-клетках. Эти результаты улучшают наше понимание болезни Дента, взятой в качестве парадигмы почечного синдрома Фанкони и нефролитиаза, и демонстрируют многочисленные роли ClC-5 в почках. Эти исследования также предоставили информацию о важных функциях, таких как апикальный эндоцитоз, обработка белков клетками почечных канальцев, метаболизм кальция и подкисление мочи.

© 2005 S. Karger AG, Базель


Введение

Камни в почках (нефролитиаз) представляют серьезную проблему для здоровья, поскольку они поражают более 10% мужчин и 5% женщин в возрасте до 70 лет и часто осложняются нефрокальцинозом и почечной недостаточностью. Нефролитиаз возникает как наследственное заболевание примерно у половины пациентов и чаще всего связан с гиперкальциурией. Биохимическая основа наследственного нефролитиаза и гиперкальциурии неизвестна, что затрудняет терапевтические разработки [1].

Недавние генетические исследования предоставили важные ключи к пониманию нефролитиаза. Три заболевания гиперкальциурического нефролитиаза (болезнь Дента и ее варианты, Х-сцепленный рецессивный нефролитиаз и Х-сцепленный рецессивный гипофосфатемический рахит) были сопоставлены с Xp11.22 [2]. Эти нарушения характеризуются дисфункцией проксимальных канальцев почек (ПТ; почечный синдром Фанкони), низкомолекулярной (НМ) протеинурией, гиперкальциурией, нефрокальцинозом, нефролитиазом и почечной недостаточностью [3].Поиск почечно-экспрессируемых генов из этого региона выявил инактивирующие мутации CLCN5 , члена семейства CLC потенциалзависимых хлоридных каналов, при болезни Дента и ее вариантах [4]. Несмотря на эти генетические достижения, механизмы, посредством которых потеря хлоридных каналов приводит к гиперкальциурии и дефектам почечных канальцев, остаются неизвестными.

В этом обзоре описывается серия молекулярных исследований, которые позволили нам изучить патофизиологию болезни Дента, взятой в качестве парадигмы заболевания почечных канальцев и нефролитиаза.Эти исследования позволили по-новому взглянуть на роль хлоридных каналов в апикальном эндоцитозе и обработке почечных канальцев белками, кальцием и протонами.

Внутрипочечное и субклеточное распределение ClC-5 указывает на патофизиологическую основу болезни Дента

CLCN5 принадлежит к семейству CLC генов потенциалзависимых хлоридных каналов, из которых девять различных членов были идентифицированы у млекопитающих. Эти хлоридные каналы важны для контроля возбудимости мембран, трансэпителиального транспорта и, возможно, регуляции клеточного объема [5]. CLCN5 преимущественно экспрессируется в почках. Он кодирует ClC-5, белок из 746 аминокислот, который индуцирует сильные выпрямляющие потоки хлоридов наружу в гетерологичных системах экспрессии. Эти токи заметно уменьшаются или устраняются при мутациях болезни Дента [3,4,5].

Чтобы понять, как потеря хлоридного канала ClC-5 приводит к множественным дефектам почечных канальцев, мы проанализировали сегментарную и субклеточную экспрессию ClC-5 в почках [6]. Иммуноблотинговые исследования идентифицировали ClC-5 ~ 80 кДа в корковом и мозговом веществе почек человека.Иммуногистохимия выявила экспрессию ClC-5 в эпителиальных клетках, выстилающих ПТ, толстую восходящую часть (TAL) петли Генле и интеркалированные клетки (IC) собирательных трубочек. Аналитическое субклеточное фракционирование почек человека показало, что ClC-5 колокализуется с вакуолярной H + -ATPase и ассоциирован с маркерами ранних эндосом (Rab 5a). Исследования конфокальной микроскопии с использованием клеток почек опоссумов (OK), модели клеток PT, подтвердили, что ClC-5 колокализуется с содержащими альбумин эндоцитарными везикулами, которые являются частью рецептор-опосредованного эндоцитарного пути [6].

В совокупности эти исследования показали, что экспрессия ClC-5 во многих сегментах нефрона может объяснить сложный фенотип болезни Дента. Потеря функции ClC-5 в TAL, которая является основным местом регулируемой реабсорбции кальция, может привести к гиперкальциурии. Поскольку реабсорбция белков LMW ограничена PT и включает эндоцитоз с последующим транспортом в кислую вакуолярно-лизосомальную систему, дисфункция ClC-5 в эндосомах PT может нарушать эндосомальное закисление и приводить к неэффективной реабсорбции LMW белков и дисфункции клеток PT. .

Характеристика мышиной модели болезни Дента с нокаутом ClC-5

Болезнь Дента, таким образом, характеризуется дефектами PT, которые включают низкомолекулярную протеинурию и обычно аминоацидурию и глюкозурию вместе с гиперкальциурией и нефрокальцинозом. Чтобы лучше понять роль ClC-5 и патофизиологию болезни Дента, мы охарактеризовали мышь с нокаутом ClC-5 (KO), полученную путем гомологичной рекомбинации, нацеленной на экзон VI Clcn5 [7]. Мыши KO были жизнеспособны при рождении и демонстрировали нормальный рост и выживаемость.Нозерн- и Вестерн-блоттинг подтвердили отсутствие ClC-5 в почках нокаутированных мышей. У мышей, лишенных ClC-5, развивались дефекты почечных канальцев, которые включали низкомолекулярную протеинурию, аминоацидурию, глюкозурию, фосфатурию и полиурию. У них также развивались гиперкальциурия и нефрокальциноз, а с возрастом наблюдалась прогрессирующая почечная недостаточность. Дальнейшие исследования показали, что гиперкальциурия у мышей ClC-5 KO имеет костное и почечное происхождение и не вызвана повышенной абсорбцией кальция в кишечнике, несмотря на повышенный уровень 1α,25-дигидроксивитамина D3 [8].

Белки LMW (<70 кДа) в норме фильтруются в клубочках и жадно захватываются рецептор-опосредованным эндоцитозом в клетках PT. ClC-5 был локализован в ранних эндосомах, принадлежащих этому пути [6]. Чтобы изучить этот процесс более подробно, мышам вводили пероксидазу, классическую эндоцитарную метку, которая фильтруется клубочком и эндоцитируется PT-клетками. Цитохимия и электронная микроскопия показали сильное нарушение эндоцитоза белков PT-клетками у мышей ClC-5 KO, так что пероксидаза, связанная с щеточной каймой, плохо переносилась в ранние эндоцитарные везикулы [7].Эти данные, которые были подтверждены на другой мышиной модели [9], показали, что нарушение рецептор-опосредованного эндоцитоза в PT-клетках Clcn5 -дефицитных мышей обеспечивает основу для дефектного поглощения и повышенной экскреции LMW белков с мочой.

Потеря ClC-5 ухудшает эндоцитоз из-за дефектного транспорта в проксимальных канальцах почек

В эндоцитозе и процессинге белков LMW участвуют мультилигандные тандемные рецепторы, мегалин и кубилин, которые обильно экспрессируются на щеточной кайме PT-клеток [10].Мегалин, крупнейший член семейства рецепторов ЛПНП, взаимодействует с кубилином, и оба рецептора интернализуются вместе. Заболевания ПТ-клеток, в совокупности называемые почечными синдромами Фанкони, характеризуются низкомолекулярной протеинурией. Это воспроизводится у мышей с нокаутом мегалина и кубилин-дефектных собак [10].

Поскольку прогрессирование по эндоцитарному аппарату зависит от эндосомального закисления, дефектный эндоцитоз, наблюдаемый у мышей с болезнью Дента [4] и ClC-5 KO [7, 9], связывают с нарушением эндосомального закисления, вторичным по отношению к потере проницаемости для хлоридов.Однако препараты, останавливающие вакуолярное закисление, не влияют на скорость эндоцитарного захвата, но ингибируют рециркуляцию или останавливают передачу в лизосомы [11]. Поэтому мы искали более специфические изменения эндоцитарного пути при болезни Дента, то есть отсутствие основных компонентов, мегалина и кубилина, на щеточной кайме. С этой целью мы тщательно охарактеризовали дефект эндоцитоза у мышей ClC-5 KO и обнаружили, что были затронуты лиганды как мегалина, так и кубилина. Затем мы показали снижение общего содержания мегалина и кубилина в почках на уровне белка, но не на уровне мРНК.Наконец, используя аналитическое субклеточное фракционирование и количественное мечение иммунозолотом, мы продемонстрировали избирательное исчезновение мегалина и кубилина на щеточной кайме клеток PT. Эти наблюдения позволили нам сделать вывод, что дефектный белковый эндоцитоз, связанный с инактивацией ClC-5, обусловлен значительной и селективной потерей мегалина и кубилина на щеточной кайме, что отражает дефект транспорта в почечных PT-клетках [11].

Измененная полярность и экспрессия H

+ -ATPase без ультраструктурных изменений в почках пациентов с болезнью Дента

Наши первоначальные исследования показали, что ClC-5 колокализуется с вакуолярной H + -ATPase в PT клетках и ICs [6 ].Исследования на мышах КО [7] установили роль ClC-5 в эндоцитозе ПТ, но последствия мутаций ClC-5 на почку человека остались неизвестными.

Мы создали многоцентровую базу данных биоптатов почек пациентов с болезнью Дента и задокументировали инактивирующие мутации ClC-5 [12]. Световая микроскопия выявила нормальную структуру почек или гломерулосклероз, канальцевую дедифференцировку и умеренный интерстициальный фиброз. Обызвествления почек выявлены на всех стадиях.Несмотря на генерализованную дисфункцию ПТ, электронная микроскопия не выявила каких-либо ультраструктурных аномалий в клетках ПТ, эндоцитарный аппарат был в норме. Однако иммуногистохимические исследования продемонстрировали последовательную инверсию полярности H + -ATPase в клетках PT к базолатеральному распределению, контрастирующему с ее апикальным расположением в нормальной почке. Эта инверсия полярности была специфической и не влияла на распределение аминопептидазы, мегалина или Na + -K + -АТФазы.Кроме того, апикальная экспрессия H + -ATPase отсутствовала в интеркалированных клетках α-типа [12]. Эти модификации полярности и/или экспрессии Н + -АТФазы указывают на взаимодействие между С-концом ClC-5 и Н + -АТФазы, которое необходимо для правильного нацеливания или стабильности последней. Эти данные важны для изучения молекулярных взаимодействий с участием ClC-5 и помогают нам понять некоторые аспекты болезни Дента, а именно дефицит подкисления мочи, наблюдаемый у некоторых пациентов [3].

Сравнительный онтогенез и сегментарное распределение ClC-5

Клинические проявления болезни Дента часто возникают в детстве, а низкомолекулярная протеинурия является постоянным признаком болезни. В частности, раннее начало некоторых случаев, когда тубулярная протеинурия выявлялась на первом месяце жизни [13], свидетельствует о том, что сегментарная экспрессия ClC-5 при ПТ должна быть приобретена до рождения. Недавно мы исследовали онтогенез ClC-5, его процессинг и сегментарное распределение во время нефрогенеза [14].Эти исследования показали, что ClC-5 подвергается быстрой индукции на ранней стадии нефрогенеза у мышей с последующим прогрессивным созреванием во время позднего нефрогенеза. Исследования с ферментом PGNase F подтвердили раннее N-связанное гликозилирование ClC-5 и прогрессивное созревание основного белка во время нефрогенеза. Распределение ClC-5 в PT и IC α-типа и его совместная локализация с H + -ATPase в этих местах уже достигаются на эмбриональный день (E) 15,5. В нефрогенезе человека ClC-5 обнаруживается в начале второго триместра с распределением, которое включает в себя развивающиеся PT-клетки, а позже — IC.Эти результаты дополняют ранние наблюдения того, что апикальная экспрессия компонентов щеточной каемки и распределение мегалина в апикальных покрытых клатрином мембранных доменах и эндосомах совпадают с началом клубочковой фильтрации у крыс [15]. Таким образом, коэкспрессия ClC-5 и Н + -АТФазы в ПТ-клетках сразу после инициации клубочковой фильтрации может свидетельствовать о прогрессирующем созревании функции почечных канальцев и объяснить снижение концентрации белков LMW в амниотической жидкости во время гестации [16]. ], а также ранние фенотипические варианты болезни Дента [13].

В дополнение к клеткам PT ClC-5 и H + -АТФаза кодируются из E15.5 у мышей в апикальной области IC α-типа [14]. В нефрогенезе человека изолированные клетки, положительные по карбоангидразе типа II (CAII), идентифицируются в зачатках мочеточников и медуллярных собирательных трубочках (CD) на 15 неделе беременности (GW), а редкие изолированные клетки, положительные по H + -АТФазе, идентифицируются. на 19 ГВт. Напротив, ClC-5 не мог быть идентифицирован в IC до 24 ГВт. Колокализация ClC-5 с CAII и/или H + -ATPase в IC наблюдалась только постнатально, что подтверждает данные, полученные в зрелой почке [6].Эти результаты предполагают видовые различия в созревании ИК [17] и подтверждают гипотезу о том, что у человека дифференцировка ИК происходит позже, чем дифференцировка основных клеток CD [18].

Последние разработки и перспективы

Следует отметить последние разработки в области молекулярной генетики и патофизиологии болезни Дента. Крайне важной информацией является демонстрация того, что болезнь Дента является генетически гетерогенной. В тщательном анализе Hoopes et al.[19] не смогли найти мутации в кодирующей последовательности и промоторных областях CLCN5 у 13 из 32 неродственных пациентов, отвечающих клиническим критериям заболевания. Кроме того, они исключили сцепление с областью CLCN5 в семье из трех поколений [19]. Эти данные позволяют предположить, что мутации в генах, отличных от CLCN5 , могут быть связаны с болезнью Дента. Эти гены предположительно кодируют белки, прямо или косвенно взаимодействующие с ClC-5. Например, в культивируемых клетках PT происхождения было зарегистрировано взаимодействие между C-концом ClC-5 и cofilin, белком, участвующим в деполимеризации актина в непосредственной близости от эндосом.Это может иметь решающее значение для опосредования поглощения белков LMW клетками PT.

Помимо генетической гетерогенности анализ мутаций предоставил ценную информацию о структуре ClC-5. Недавно были установлены рентгеновские кристаллические структуры двух бактериальных белков CLC с разрешением 3,0 Å [21], что подтверждает предсказание о том, что каналы CLC представляют собой гомодимеры с двойной конфигурацией ствола. Каждая субъединица имеет собственную пору и 17 встроенных в плазматическую мембрану α-спиралей с антипараллельной ориентацией, объединяющей остатки, ответственные за анионную селективность [21].На основании этих данных была создана модель ClC-5 человека, позволяющая анализировать роль 15 неусекающих мутаций (14 миссенс и одна внутрирамочная делеция) CLCN5 [22]. Этот анализ показал, что ни одна из этих мутаций не связана с фильтром селективности, но большинство из них (12/15) сгруппированы на границе раздела двух субъединиц гомодимерного канала [22]. Функциональная оценка других встречающихся в природе мутантов необходима для того, чтобы определить роль консервативных доменов для функции ClC-5 и/или доставки: речь идет о мотиве интернализации С-конца, напоминающем мотив PY, который необходим для интернализация и деградация эпителиального натриевого канала, ENaC [23].

Помимо клеток PT и IC, ClC-5 экспрессируется в TAL петли Генле [6], но его роль в этом сегменте остается неясной. Однако недавние данные, полученные на культивируемых мышиных клеточных линиях TAL, а также на мышах, подвергшихся водной депривации, позволяют предположить, что воздействие гипертонуса повышает экспрессию ClC-5 на уровне мРНК и белка. Таким образом, регуляция экспрессии ClC-5 может иметь решающее значение для адаптации к гипертонической среде и сохранения правильной эндоцитарной активности/нацеливания в клетках TAL [24].

Центральная гипотеза состоит в том, что ClC-5 обеспечивает проводимость хлоридов, необходимую для эндосомального закисления электрогенной вакуолярной H + -ATPase [7, 9, 25]. Основываясь на уменьшении АТФ-зависимого тушения флуоресценции везикул низкой плотности, выделенных от мышей ClC-5 KO, нагруженных in vitro акридиновым оранжевым, предварительные данные Gunther et al. [26] поддерживают эту точку зрения. Однако эти везикулы не были охарактеризованы как ранние эндосомы (хорошо задокументированный дефект переноса в PT-клетках мышей ClC-5 KO может ухудшить их очистку и привести к контаминации неэндоцитарными подкисленными органеллами), а остаточное тушение в этих везикулах KO по-прежнему проявляли зависимость от хлорида [26].Другими словами, решающую роль ClC-5 в эндосомальном закислении еще предстоит доказать.

Выводы

Описанные здесь исследования предоставили важную информацию для понимания патофизиологии болезни Дента, взятой в качестве парадигмы почечного синдрома Фанкони и нефролитиаза. Характеристика клеточного и субклеточного распределения ClC-5 и подробные исследования на мышах ClC-5 KO продемонстрировали множество ролей этого хлоридного канала в почках.Эти исследования также предоставили новое понимание основных функций, таких как апикальный эндоцитоз, обработка белков клетками почечных канальцев, метаболизм кальция и подкисление мочи. Эта информация и проверка мышиной модели, которая обладает такими важными признаками, как гиперкальциурия и нефрокальциноз, теперь должны оказаться полезными при разработке терапевтических стратегий, актуальных для болезни Дента, почечных синдромов Фанкони и камней в почках.

Благодарности

Авторы благодарят Р.Боуэнс, Э.И. Кристенсен, С. Гуджино, В.Б. Гуджино, Т. Игараши, Т. Дженч, П. Мулен, С. Шейнман, Р. Таккер и М.-Ф. Van Den Hove за поддержку и плодотворные обсуждения. Эти исследования были поддержаны бельгийским Фондом Фортона, FSR (UCL), FNRS и ARC.

Ссылки

  1. Coe FL, Parks JH, Asplin JR: Патогенез и лечение камней в почках.N Engl J Med 1992; 327:1141–1152.
  2. Шейнман С.Дж., Пок М.А., Вудинг С., Панг Дж.Т., Фраймойер П.А., Таккер Р.В.: Сопоставление гена, вызывающего Х-сцепленный рецессивный нефролитиаз, с Xp11.22 с помощью исследований сцепления. J Clin Invest 1993; 91: 2351–2357.
  3. Шейнман С.Дж.: Сцепленный с Х-хромосомой гиперкальциурический нефролитиаз: клинические синдромы и мутации хлоридных каналов.Kidney Int 1998; 53:3–17.
  4. Lloyd SE, Pearce SHS, Fisher SE и др.: Общая молекулярная основа для трех наследственных заболеваний почек. Природа 1996; 379: 445–449.
  5. Йенч Т.Дж., Штейн В., Вайнрайх Ф., Здебик А.А. Молекулярная структура и физиологическая функция хлоридных каналов.Physiol Rev 2002; 82: 503–568.
  6. Devuyst O, Christie PT, Courtoy PJ, Beauwens R, Thakker RV: Внутрипочечное и субклеточное распределение хлоридного канала человека, CLC-5, раскрывает патофизиологическую основу болезни Дента. Hum Mol Genet 1999; 8: 247–257.
  7. Wang SS, Devuyst O, Courtoy PJ и др.: Мыши, у которых отсутствует почечный хлоридный канал, ClC-5, являются моделью болезни Дента, нефролитиаза, связанного с дефектным рецептор-опосредованным эндоцитозом.Hum Mol Genet 2000; 9: 2937–2945.
  8. Сильва И.В., Чеботару В., Ван Х. и др. Модель болезни Дента на мышах с нокаутом ClC-5 характеризуется почечной гиперкальциурией и повышенным костным метаболизмом. J Bone Miner Res 2003; 18: 615–623.
  9. Piwon N, Gunther W, Schwake M, Bosl MR, Jentsch TJ: ClC-5 Cl нарушение канала нарушает эндоцитоз в мышиной модели болезни Дента.Природа 2000; 408: 369–373.
  10. Кристенсен Э.И., Бирн Х.: Мегалин и кубилин: многофункциональные эндоцитарные рецепторы. Nat Rev Mol Cell Biol 2002; 3: 256–266.
  11. Кристенсен Э.И., Девуйст О., Дом Г. и др.: Потеря хлоридного канала ClC-5 ухудшает эндоцитоз из-за дефектного транспорта мегалина и кубилина в проксимальных канальцах почек.Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:8472–8477.
  12. Мулен П., Игараши Т., Ван дер Смиссен П. и др.: Измененная полярность и экспрессия H + -АТФазы без ультраструктурных изменений в почках пациентов с болезнью Дента. Kidney Int 2003; 63: 1285–1295.
  13. Bosio M, Bianchi ML, Lloyd SE, Thakker RV: Семейный синдром из-за мутации Arg648Stop в X-сцепленном гене почечного хлоридного канала.Pediatr Nephrol 1999;13:278–283.
  14. Jouret F, Igarashi T, Gofflot F, Wilson PD, Karet FE, Thakker RV, Devuyst O: Сравнительный онтогенез, обработка и сегментарное распределение почечного хлоридного канала, ClC-5. Kidney Int 2004; 65: 198–208.
  15. Бимесдерфер Д., Декан Г., Аронсон П., Фаркуар М.Г.: Сборка характерных покрытых микродоменов ямок и микроворсинок в щеточной кайме почки.Am J Physiol 1992; 262: F55–F67.
  16. Муссап М., Фанос В., Пикколи А. и др.: Низкомолекулярные белки и ферменты мочи в амниотической жидкости здоровых беременных женщин на прогрессивных стадиях беременности. Clin Biochem 1996; 29:51–56.
  17. Ким Дж., Тишер С.К., Мэдсен К.М.: Дифференциация интеркалированных клеток в развивающихся почках крыс: иммуногистохимическое исследование.Am J Physiol 1994; 266: F977–F990.
  18. Девуйст О., Берроу К.Р., Смит Б.Л. и др.: Экспрессия аквапоринов-1 и -2 во время нефрогенеза и при аутосомно-доминантном поликистозе почек. Am J Physiol 1996; 271: F169–F183.
  19. Hoopes RR Jr, Raja KM, Koich A, Hueber P, Reid R, Knohl SJ, Scheinman SJ: Доказательства генетической гетерогенности болезни Дента.Kidney Int 2004; 65: 1615–1620.
  20. Hryciw DH, Wang Y, Devuyst O, Pollock CA, Poronnik P, Guggino WB: Кофилин взаимодействует с ClC-5 и регулирует поглощение альбумина в клеточных линиях проксимальных канальцев. J Biol Chem 2003; 278:40169–40176.
  21. Дутцлер Р., Кэмпбелл Э.Б., Каден М., Чайт Б.Т., Маккиннон Р.: Рентгеновская структура хлоридного канала ClC в позиции 3.0 A раскрывает молекулярную основу анионной селективности. Природа 2002; 415: 287–294.
  22. Wu F, Roche P, Christie PT, Loh NY, Reed AA, Esnouf RM, Thakker RV: Родственное моделирование мутаций хлоридного канала в почках человека (hCLC-5) предполагает структурно-функциональную взаимосвязь. Kidney Int 2003; 63: 1426–1432.
  23. Schwake M, Friedrich T, Jentsch TJ: Сигнал интернализации в ClC-5, эндосомальном Cl-канале, мутировавшем при болезни Дента. J Biol Chem 2001; 276:12049–12054.
  24. Pham PC, Devuyst O, Pham PT, Matsumoto N, Shih RN, Jo OD, Yanagawa N, Sun AM: Гипертонус увеличивает экспрессию CLC-5 в толстых медуллярных клетках восходящей конечности мыши.Am J Physiol Renal Physiol 2004; 287: F747–F752.
  25. Faundez V, Hartzell HC: Внутриклеточные хлоридные каналы: детерминанты функции в эндосомальном пути. Sci STKE 2004 11 мая 2004 г. (233): re8.
  26. Гюнтер В., Пивон Н., Дженч Т.Дж.: Мышь с нокаутом хлоридного канала ClC-5 — модель болезни Дента на животных.Pflugers Arch 2003; 445: 456–462.

Автор Контакты

Olivier Devuyst

Отделение нефрологии Медицинской школы UCL

10 Avenue Hippocrate

B–1200 Брюссель (Бельгия)

Тел. +32 2 764 18 55, факс +32 2 764 54 55, электронная почта [email protected]


Информация о статье / публикации

Предварительный просмотр первой страницы

Опубликовано в сети: 24 февраля 2005 г.
Дата выпуска выпуска: март 2005 г.

Количество печатных страниц: 1
Количество фигурок: 0
Количество столов: 0


eISSN: 1660-2137 (онлайн)

Для получения дополнительной информации: https://www.karger.com/НЭП


Авторское право / Дозировка препарата / Отказ от ответственности

Авторское право: Все права защищены. Никакая часть данной публикации не может быть переведена на другие языки, воспроизведена или использована в любой форме и любыми средствами, электронными или механическими, включая фотокопирование, запись, микрокопирование или любую систему хранения и поиска информации, без письменного разрешения издателя. .
Дозировка препарата: авторы и издатель приложили все усилия, чтобы гарантировать, что выбор препарата и дозировка, указанные в этом тексте, соответствуют текущим рекомендациям и практике на момент публикации.Тем не менее, в связи с продолжающимися исследованиями, изменениями в правительственных постановлениях и постоянным потоком информации, касающейся лекарственной терапии и реакций на лекарства, читателю настоятельно рекомендуется проверять вкладыш в упаковке для каждого лекарства на предмет любых изменений в показаниях и дозировке, а также для дополнительных предупреждений. и меры предосторожности. Это особенно важно, когда рекомендуемый агент является новым и/или редко используемым лекарственным средством.
Отказ от ответственности: заявления, мнения и данные, содержащиеся в этой публикации, принадлежат исключительно отдельным авторам и участникам, а не издателям и редакторам.Появление рекламы и/или ссылок на продукты в публикации не является гарантией, одобрением или одобрением рекламируемых продуктов или услуг или их эффективности, качества или безопасности. Издатель и редактор(ы) отказываются от ответственности за любой ущерб, нанесенный людям или имуществу в результате любых идей, методов, инструкций или продуктов, упомянутых в содержании или рекламе.

.

Похожие записи

При гормональном сбое можно ли похудеть: как похудеть при гормональном сбое

Содержание Как похудеть после гормональных таблетокЧто такое гормональные таблеткиПочему прием гормонов ведет к избыточному весу (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({}); […]

Гипотензивные средства при гиперкалиемии: Гипотензивные средства при гиперкалиемии — Давление и всё о нём

Содержание Препараты, применяемые для лечения гипертонической болезни | Илларионова Т.С., Стуров Н.В., Чельцов В.В.Основные принципы антигипертензивной терапииКлассификация Агонисты имидазолиновых I1–рецепторов […]

Прикорм таблица детей до года: Прикорм ребенка — таблица прикорма детей до года на грудном вскармливании и искусственном

Содержание Прикорм ребенка — таблица прикорма детей до года на грудном вскармливании и искусственномКогда можно и нужно вводить прикорм грудничку?Почему […]

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *